ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד
Summary
מיקרוסקופיה הקפאה-אלקטרונית של חלקיק יחיד דורשת חבילת תוכנה מתאימה וצנרת ידידותית למשתמש לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. כאן, אנו מציגים את היישום של חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות, Latitude-S, וצינור מעשי לאיסוף נתונים של ביומולקולים משוקלים בתנאים במינון נמוך.
Abstract
בשנים האחרונות, ההתקדמות הטכנולוגית והמתודולוגית במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד (cryo-EM) סללה דרך חדשה לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים. למרות ההתקדמות המדהימה בהקפאה-EM, עדיין יש היקף לשיפור בהיבטים שונים של זרימת העבודה של ניתוח חלקיקים בודדים. ניתוח חלקיקים בודדים דורש חבילת תוכנה מתאימה לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. בשמונה השנים האחרונות פותחו מספר חבילות תוכנה אוטומטיות לרכישת נתונים להדמיה אוטומטית עבור קריו-EM של חלקיק יחיד. מאמר זה מציג יישום של צינור רכישת תמונה אוטומטי לחלוטין עבור biomolecules מנוצל בתנאים במינון נמוך.
הוא מדגים חבילת תוכנה, שיכולה לאסוף נתוני cryo-EM באופן מלא, אוטומטי ומדויק. בנוסף, פרמטרים מיקרוסקופיים שונים נשלטים בקלות על ידי חבילת תוכנה זו. פרוטוקול זה מדגים את הפוטנציאל של חבילת תוכנה זו בהדמיה אוטומטית של תסמונת הנשימה החריפה החמורה-נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) חלבון ספייק עם מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים 200 keV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר (DED). כ-3,000 תמונות של סרטי קריו-EM נרכשו במפגש אחד (48 שעות) של איסוף נתונים, שהניבו מבנה ברזולוציה אטומית של חלבון הספייק של SARS-CoV-2. יתר על כן, מחקר מבני זה מצביע על כך שחלבון הספייק מאמץ שני קונפורמציות עיקריות, 1-RBD (תחום מחייב קולטן) פתוח וכל RBD למטה קונפורמציות סגורות.
Introduction
קריו-EM חלקיק יחיד הפך טכניקה ביולוגית מבנית המיינסטרים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של macromolecules ביולוגי1. שחזור חלקיק יחיד תלוי ברכישת מספר עצום של מיקרוגרפים של דגימות מוויטוריות כדי לחלץ תמונות חלקיקים דו-ממדיות (2D), המשמשות לאחר מכן לשחזור מבנה תלת מימדי (תלת-ממדי) של מקרו-קולקול ביולוגי2,3. לפני הפיתוח של DEDs, ההחלטה שהושגה משחזור חלקיק יחיד נע בין 4 ל 30 Å4,5. לאחרונה, הרזולוציה ברת השגה של קריו-EM חלקיק יחיד הגיעה מעבר 1.8 Å6. DED ותוכנה אוטומטית לרכישת נתונים היו התורמים העיקריים למהפכת החלטה זו7, שבה ההתערבות האנושית באיסוף נתונים היא מינימלית. בדרך כלל, הדמיית cryo-EM מבוצעת בשיעורי מינון אלקטרונים נמוכים (20-100 e/Å2) כדי למזער נזקי קרינה הנגרמים על ידי קרן אלקטרונים של דגימות ביולוגיות, מה שתורם ליחס האות לרעש הנמוך (SNR) בתמונה. SNR נמוך זה מונע את האפיון של המבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים באמצעות ניתוח חלקיקים בודדים.
גלאי האלקטרונים מהדור החדש הם גלאים מבוססי CMOS (מוליכים למחצה משלימים של תחמוצת מתכת), שיכולים להתגבר על מכשולים נמוכים אלה הקשורים ל- SNR. מצלמות CMOS לזיהוי ישיר אלה מאפשרות קריאה מהירה של האות, שבגללו המצלמה תורמת פונקציית התפשטות נקודה טובה יותר, SNR מתאים ויעילות קוונטית בלשית מעולה (DQE) עבור מקרומולקולים ביולוגיים. מצלמות זיהוי ישיר מציעות SNR8 גבוה ורעש נמוך בתמונות המוקלטות, וכתוצאה מכך עלייה כמותית ביעילות הקוונטית הבלשית (DQE) – מדד של כמות הרעש שהגלאי מוסיף לתמונה. מצלמות אלה גם מקליטות סרטים במהירות של מאות פריימים לשנייה, מה שמאפשר רכישת נתונים מהירה9,10. כל המאפיינים האלה הופכים מצלמות זיהוי ישיר מהירות המתאימות ליישומים במינון נמוך.
תמונות מחסנית מתוקנות בתנועה משמשות לעיבוד נתונים כדי לחשב סיווג 2D ולשחזר מפת צפיפות תלת-ממדית של פקודות מאקרו באמצעות חבילות תוכנה שונות כגון RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 ו- EMAN215. עם זאת, עבור ניתוח חלקיקים בודדים, ערכת נתונים עצומה נדרשת כדי להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה. לכן, אגרת רכישת נתונים אוטומטית חיונית מאוד לאיסוף נתונים. כדי להקליט ערכות נתונים גדולות של Cryo-EM, נעשה שימוש במספר חבילות תוכנה בעשור האחרון. חבילות תוכנה ייעודיות, כגון AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ו- EPU, פותחו לרכישת נתונים אוטומטית.
חבילות תוכנה אלה משתמשות במשימות שגרתיות כדי למצוא מיקומי חור באופן אוטומטי על-ידי מתאם התמונות בהגדלה נמוכה לתמונות בהגדלה גבוהה, המסייעת בזיהוי חורים עם קרח מרץ של עובי קרח ניכוס לרכישת תמונה בתנאים במינון נמוך. חבילות תוכנה אלה הפחיתו את מספר המשימות החוזרות ונשנות והגדילו את התפוקה של איסוף נתוני cryo-EM על ידי רכישת כמות עצומה של נתונים באיכות טובה במשך מספר ימים ברציפות, ללא כל הפרעה ונוכחות פיזית של המפעיל. Latitude-S היא חבילת תוכנה דומה, המשמשת לרכישת נתונים אוטומטית לניתוח חלקיקים בודדים. עם זאת, חבילת תוכנה זו מתאימה רק למטעני K2/K3 ומסופק לגלאים אלה.
פרוטוקול זה מדגים את הפוטנציאל של Latitude-S ברכישת תמונה אוטומטית של חלבון ספייק SARS-CoV-2 עם גלאי אלקטרונים ישיר המצויד בהקפאה-EM של 200 keV (ראה טבלת החומרים). באמצעות כלי איסוף נתונים זה, 3,000 קבצי סרט של חלבון ספייק SARS-CoV-2 נרכשים באופן אוטומטי, ועיבוד נתונים נוסף מתבצע כדי להשיג מבנה חלבון ספייק ברזולוציה של 3.9-4.4 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S הוא ממשק משתמש אינטואיטיבי, המספק סביבה להפעלה ואיסוף אוטומטי של אלפי מיקרוגרפים ברזולוציה גבוהה או קבצי סרטים ביומיים. הוא מספק ניווט קל על פני הרשתות ושומר על המיקום של שלב המיקרוסקופ בזמן שהוא עובר מהגדלה נמוכה להגדלה גבוהה. כל שלב של רכישת נתונים עם Latitude-S הוא חסכוני בזמן, עם תכונ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים במחלקה לביוטכנולוגיה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (DST) ומדע, והמשרד לפיתוח משאבי אנוש (MHRD), הודו, למימון ומתקן ה- cryo-EM ב- IISc-Bangalore. אנו מכירים בתוכנית בונה DBT (BT/INF/22/SP22844/2017) ו-DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) עבור מתקן הקריו-EM הלאומי ב- IISc, בנגלור. אנו מכירים בתמיכה כספית של המועצה לחקר המדע וההנדסה (SERB) (מענק מס’-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 ו-SERB-IPA/2020/000094), DBT (מענק מס’. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). אנו מודים לגברת אישיקה פרמניק על הכנת רשתות קריו-EM, איסוף נתונים של cryo-EM והכנת טבלת החומרים. אנו מודים גם למר סומאן מישרה על עיבוד התמונה cryo-EM ועל שעזר לנו להכין את הדמויות. אנו מודים לפרופ’ רגהאבן ורדרג’אן על שעזר לנו להשיג את דגימת חלבון הספייק המטוהרת עבור מחקר זה.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy – TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
