Benutzerfreundliche Datenerfassungssoftware mit hohem Durchsatz und vollautomatischer Datenerfassung für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie
Summary
Die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie erfordert ein geeignetes Softwarepaket und eine benutzerfreundliche Pipeline für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. Hier präsentieren wir die Anwendung eines vollautomatischen Bilderfassungssoftwarepakets, Latitude-S, und einer praktischen Pipeline zur Datenerfassung von vitrifizierten Biomolekülen unter niedrig dosierten Bedingungen.
Abstract
Technologische und methodische Fortschritte in der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben in den vergangenen Jahren einen neuen Weg für die hochauflösende Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle eröffnet. Trotz der bemerkenswerten Fortschritte in der Kryo-EM gibt es noch Raum für Verbesserungen in verschiedenen Aspekten des Einzelpartikelanalyse-Workflows. Die Einzelpartikelanalyse erfordert ein geeignetes Softwarepaket für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. In den letzten acht Jahren wurden mehrere Softwarepakete für die automatische Datenerfassung für die automatische Bildgebung von Einzelpartikel-Kryo-EM entwickelt. Dieser Beitrag stellt eine Anwendung einer vollautomatischen Bilderfassungspipeline für vitrifizierte Biomoleküle unter niedrig dosierten Bedingungen vor.
Es demonstriert ein Softwarepaket, das Kryo-EM-Daten vollständig, automatisch und präzise sammeln kann. Darüber hinaus können verschiedene mikroskopische Parameter durch dieses Softwarepaket einfach gesteuert werden. Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial dieses Softwarepakets bei der automatisierten Bildgebung des Spike-Proteins SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus 2) mit einem 200-keV-Kryo-Elektronenmikroskop, das mit einem direkten Elektronendetektor (DED) ausgestattet ist. Rund 3.000 Kryo-EM-Filmbilder wurden in einer einzigen Sitzung (48 h) der Datenerhebung aufgenommen, was zu einer atomaren Auflösungsstruktur des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 führte. Darüber hinaus zeigt diese Strukturstudie, dass das Spike-Protein zwei Hauptkonformationen annimmt, 1-RBD (Rezeptor-bindende Domäne) offen und alle RBD nach unten geschlossenen Konformationen.
Introduction
Einzelpartikel-Kryo-EM hat sich zu einer gängigen strukturbiologischen Technik zur hochauflösenden Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle entwickelt1. Die Einzelpartikelrekonstruktion hängt von der Aufnahme einer großen Anzahl von Mikroaufnahmen von verglasten Proben ab, um zweidimensionale (2D) Partikelbilder zu extrahieren, die dann verwendet werden, um eine dreidimensionale (3D) Struktur eines biologischen Makromoleküls zu rekonstruieren2,3. Vor der Entwicklung von DEDs lag die durch die Einzelpartikelrekonstruktion erreichte Auflösung zwischen 4 und 30 Å4,5. Vor kurzem hat die erreichbare Auflösung von Einzelpartikel-Kryo-EM mehr als 1,8 Å6 erreicht. DED und automatisierte Datenerfassungssoftware haben wesentlich zu dieser Auflösungsrevolution beigetragen7, bei der menschliche Eingriffe zur Datenerfassung minimal sind. Im Allgemeinen wird die Kryo-EM-Bildgebung bei niedrigen Elektronendosisraten (20-100 e/Å2) durchgeführt, um die durch Elektronenstrahle induzierte Strahlenschädigung biologischer Proben zu minimieren, was zu dem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Bild beiträgt. Diese niedrige SNR behindert die Charakterisierung der hochauflösenden Strukturen biologischer Makromoleküle mittels Einzelpartikelanalyse.
Die Elektronendetektoren der neuen Generation sind CMOS-basierte Detektoren (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor), die diese niedrigen SNR-bezogenen Hindernisse überwinden können. Diese CMOS-Kameras mit direkter Detektion ermöglichen ein schnelles Auslesen des Signals, wodurch die Kamera eine bessere Punktspreizungsfunktion, ein geeignetes SNR und eine hervorragende Detektivquanteneffizienz (DQE) für biologische Makromoleküle beiträgt. Direktdetektionskameras bieten ein hohes SNR8 und ein geringes Rauschen in den aufgenommenen Bildern, was zu einer quantitativen Steigerung der Detektivquanteneffizienz (DQE) führt – ein Maß dafür, wie viel Rauschen ein Detektor zu einem Bild hinzufügt. Diese Kameras zeichnen auch Filme mit einer Geschwindigkeit von Hunderten von Bildern pro Sekunde auf, was eine schnelle Datenerfassung ermöglicht9,10. All diese Eigenschaften machen schnelle Direktdetektionskameras für anwendungen mit niedriger Dosis geeignet.
Bewegungskorrigierte Stapelbilder werden für die Datenverarbeitung verwendet, um die 2D-Klassifizierung zu berechnen und eine 3D-Dichtekarte von Makromolekülen mit verschiedenen Softwarepaketen wie RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 und EMAN215 zu rekonstruieren. Für die Einzelpartikelanalyse ist jedoch ein enormer Datensatz erforderlich, um eine hochauflösende Struktur zu erreichen. Daher sind automatische Datenerfassungsmauten für die Datenerfassung von großer Bedeutung. Um große Kryo-EM-Datensätze zu erfassen, wurden in den letzten zehn Jahren mehrere Softwarepakete verwendet. Dedizierte Softwarepakete wie AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS und EPU wurden für die automatisierte Datenerfassung entwickelt.
Diese Softwarepakete verwenden Routineaufgaben, um Bohrungspositionen automatisch zu finden, indem sie die Bilder mit geringer Vergrößerung mit Bildern mit hoher Vergrößerung korrelieren, was bei der Identifizierung von Löchern mit glasigem Eis von geeigneter Eisdicke für die Bildaufnahme unter niedrig dosierten Bedingungen hilft. Diese Softwarepakete haben die Anzahl der sich wiederholenden Aufgaben reduziert und den Durchsatz der Kryo-EM-Datenerfassung erhöht, indem sie mehrere Tage lang kontinuierlich eine große Menge an qualitativ hochwertigen Daten ohne Unterbrechung und die physische Anwesenheit des Bedieners erfasst haben. Latitude-S ist ein ähnliches Softwarepaket, das zur automatischen Datenerfassung für die Einzelpartikelanalyse verwendet wird. Dieses Softwarepaket ist jedoch nur für K2/K3-DEDs geeignet und wird mit diesen Detektoren ausgeliefert.
Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial von Latitude-S bei der automatisierten Bilderfassung des SARS-CoV-2-Spikeproteins mit einem direkten Elektronendetektor, der mit einem 200 keV Kryo-EM ausgestattet ist (siehe Materialtabelle). Mit diesem Datenerfassungstool werden automatisch 3.000 Filmdateien des SARS-CoV-2-Spike-Proteins erfasst und eine weitere Datenverarbeitung durchgeführt, um eine Spike-Proteinstruktur mit einer Auflösung von 3,9-4,4 Å zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S ist eine intuitive Benutzeroberfläche, die eine Umgebung zum automatischen Einrichten und Sammeln von Tausenden von hochauflösenden Mikroaufnahmen oder Filmdateien in zwei Tagen bietet. Es bietet eine einfache Navigation durch die Gitter und behält die Position des Mikroskoptisches bei, während es sich von niedriger Vergrößerung zu hoher Vergrößerung bewegt. Jeder Schritt der Datenerfassung mit Latitude-S ist zeiteffizient, mit Funktionen wie einer einfachen Benutzeroberfläche, schnellem Streaming von…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Department of Biotechnology, dem Department of Science and Technology (DST) and Science und dem Ministry of Human Resource Development (MHRD), Indien, für die Finanzierung und die Kryo-EM-Einrichtung am IISc-Bangalore. Wir erkennen das DBT-BUILDER-Programm (BT/INF/22/SP22844/2017) und DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) für die National Cryo-EM-Einrichtung am IISc, Bangalore, an. Wir danken der finanziellen Unterstützung durch das Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 und SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Wir danken Frau Ishika Pramanick für die Vorbereitung von Kryo-EM-Gittern, die Kryo-EM-Datenerfassung und die Erstellung der Materialtabelle. Wir danken auch Herrn Suman Mishra für die Kryo-EM-Bildverarbeitung und die Unterstützung bei der Erstellung der Zahlen. Wir danken Prof. Raghavan Varadarajan dafür, dass er uns geholfen hat, die gereinigte Spike-Protein-Probe für diese Studie zu erhalten.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
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