Software de adquisición de datos fácil de usar, de alto rendimiento y totalmente automatizado para microscopía crioelectrónica de partícula única
Summary
La microscopía crioelectrónica de una sola partícula exige un paquete de software adecuado y una canalización fácil de usar para la adquisición automática de datos de alto rendimiento. Aquí, presentamos la aplicación de un paquete de software de adquisición de imágenes totalmente automatizado, Latitude-S, y una tubería práctica para la recopilación de datos de biomoléculas vitrificadas en condiciones de dosis bajas.
Abstract
En los últimos años, los avances tecnológicos y metodológicos en la microscopía crioelectrónica de una sola partícula (cryo-EM) han allanado una nueva vía para la determinación de la estructura de alta resolución de macromoléculas biológicas. A pesar de los notables avances en crio-EM, todavía hay margen de mejora en varios aspectos del flujo de trabajo de análisis de partículas individuales. El análisis de una sola partícula exige un paquete de software adecuado para la adquisición automática de datos de alto rendimiento. En los últimos ocho años se desarrollaron varios paquetes de software de adquisición automática de datos para imágenes automáticas para cryo-EM de una sola partícula. Este artículo presenta una aplicación de una tubería de adquisición de imágenes totalmente automatizada para biomoléculas vitrificadas en condiciones de dosis bajas.
Demuestra un paquete de software, que puede recopilar datos crio-EM de forma completa, automática y precisa. Además, varios parámetros microscópicos son fácilmente controlados por este paquete de software. Este protocolo demuestra el potencial de este paquete de software en imágenes automatizadas de la proteína espiga del síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) con un microscopio crioelectrónico de 200 keV equipado con un detector de electrones directo (DED). Se adquirieron alrededor de 3.000 imágenes de películas crio-EM en una sola sesión (48 h) de recopilación de datos, lo que produjo una estructura de resolución atómica de la proteína espiga del SARS-CoV-2. Además, este estudio estructural indica que la proteína espiga adopta dos conformaciones principales, 1-RBD (dominio de unión al receptor) abierta hacia arriba y todas las conformaciones RBD hacia abajo cerradas.
Introduction
La crio-EM de una sola partícula se ha convertido en una técnica de biología estructural convencional para la determinación de la estructura de alta resolución de macromoléculas biológicas1. La reconstrucción de una sola partícula depende de la adquisición de un gran número de micrografías de muestras vitrificadas para extraer imágenes de partículas bidimensionales (2D), que luego se utilizan para reconstruir una estructura tridimensional (3D) de una macromolécula biológica2,3. Antes del desarrollo de los DED, la resolución lograda a partir de la reconstrucción de una sola partícula oscilaba entre 4 y 30 Å4,5. Recientemente, la resolución alcanzable de la crio-EM de una sola partícula ha alcanzado más allá de 1,8 Å6. El DED y el software automatizado de adquisición de datos han sido los principales contribuyentes a esta revolución de la resolución7, donde la intervención humana para la recopilación de datos es mínima. En general, las imágenes crio-EM se realizan a bajas tasas de dosis de electrones (20-100 e / Å2) para minimizar el daño por radiación inducido por el haz de electrones de las muestras biológicas, lo que contribuye a la baja relación señal-ruido (SNR) en la imagen. Este bajo SNR impide la caracterización de las estructuras de alta resolución de macromoléculas biológicas mediante análisis de partículas individuales.
Los detectores de electrones de nueva generación son detectores basados en CMOS (semiconductores complementarios de óxido de metal), que pueden superar estos obstáculos relacionados con el bajo SNR. Estas cámaras CMOS de detección directa permiten una lectura rápida de la señal, debido a que la cámara contribuye con una mejor función de propagación de puntos, SNR adecuado y una excelente eficiencia cuántica de detección (DQE) para macromoléculas biológicas. Las cámaras de detección directa ofrecen un alto SNR8 y bajo ruido en las imágenes grabadas, lo que resulta en un aumento cuantitativo en la eficiencia cuántica del detective (DQE), una medida de la cantidad de ruido que un detector agrega a una imagen. Estas cámaras también graban películas a la velocidad de cientos de fotogramas por segundo, lo que permite una rápida adquisición de datos9,10. Todas estas características hacen que las cámaras de detección directa rápida sean adecuadas para aplicaciones de dosis bajas.
Las imágenes de pila corregidas por movimiento se utilizan para el procesamiento de datos para calcular la clasificación 2D y reconstruir un mapa de densidad 3D de macromoléculas mediante el uso de varios paquetes de software como RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 y EMAN215. Sin embargo, para el análisis de una sola partícula, se requiere un enorme conjunto de datos para lograr una estructura de alta resolución. Por lo tanto, los peajes automáticos de adquisición de datos son muy esenciales para la recopilación de datos. Para registrar grandes conjuntos de datos crio-EM, se han utilizado varios paquetes de software en la última década. Se han desarrollado paquetes de software dedicados, como AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS y EPU, para la adquisición automatizada de datos.
Estos paquetes de software utilizan tareas rutinarias para encontrar posiciones de agujeros automáticamente correlacionando las imágenes de bajo aumento con imágenes de alto aumento, lo que ayuda a identificar agujeros con hielo vítreo de espesor de hielo apropiado para la adquisición de imágenes en condiciones de dosis bajas. Estos paquetes de software han reducido el número de tareas repetitivas y han aumentado el rendimiento de la recopilación de datos crio-EM al adquirir una gran cantidad de datos de buena calidad durante varios días continuamente, sin ninguna interrupción y la presencia física del operador. Latitude-S es un paquete de software similar, que se utiliza para la adquisición automática de datos para el análisis de partículas individuales. Sin embargo, este paquete de software solo es adecuado para DED K2 / K3 y se proporciona con estos detectores.
Este protocolo demuestra el potencial de Latitude-S en la adquisición automatizada de imágenes de la proteína espiga del SARS-CoV-2 con un detector de electrones directo equipado con un crio-EM de 200 keV (ver la Tabla de Materiales). Utilizando esta herramienta de recopilación de datos, se adquieren automáticamente 3.000 archivos de película de la proteína espiga del SARS-CoV-2, y se lleva a cabo un procesamiento adicional de datos para obtener una estructura de proteína espiga de resolución 3.9-4.4 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S es una interfaz de usuario intuitiva, que proporciona un entorno para configurar y recopilar automáticamente miles de micrografías de alta resolución o archivos de película en dos días. Proporciona una fácil navegación a través de las rejillas y mantiene la posición de la etapa del microscopio mientras se mueve de bajo aumento a alto aumento. Cada paso de la adquisición de datos con Latitude-S es eficiente en el tiempo, con características como una interfaz de usuario simple, transmisión rápida de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos al Departamento de Biotecnología, al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST) y Ciencia, y al Ministerio de Desarrollo de Recursos Humanos (MHRD), India, por la financiación y la instalación de crio-EM en IISc-Bangalore. Reconocemos el Programa DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) y DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) para la instalación nacional de Cryo-EM en IISc, Bangalore. Agradecemos el apoyo financiero de la Junta de Investigación en Ciencia e Ingeniería (SERB) (Subvención No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 y SERB-IPA/2020/000094), DBT (Subvención No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Agradecemos a la Sra. Ishika Pramanick por preparar las rejillas crio-EM, la recopilación de datos crio-EM y la preparación de la Tabla de Materiales. También agradecemos al Sr. Suman Mishra por el procesamiento de imágenes crio-EM y por ayudarnos a preparar las figuras. Agradecemos al Prof. Raghavan Varadarajan por ayudarnos a obtener la muestra de proteína espiga purificada para este estudio.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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