एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल, उच्च-थ्रूपुट, और पूरी तरह से स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर
Summary
एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी उच्च-थ्रूपुट स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर पैकेज और उपयोगकर्ता के अनुकूल पाइपलाइन की मांग करती है। यहां, हम एक पूरी तरह से स्वचालित छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज, अक्षांश-एस, और कम खुराक की स्थिति के तहत विट्रीफाइड बायोमोलेक्यूल्स के डेटा संग्रह के लिए एक व्यावहारिक पाइपलाइन के आवेदन को प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
पिछले कई वर्षों में, एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) में तकनीकी और पद्धतिगत प्रगति ने जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए एक नया एवेन्यू प्रशस्त किया है। क्रायो-ईएम में उल्लेखनीय प्रगति के बावजूद, एकल-कण विश्लेषण वर्कफ़्लो के विभिन्न पहलुओं में सुधार के लिए अभी भी गुंजाइश है। एकल-कण विश्लेषण उच्च-थ्रूपुट स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर पैकेज की मांग करता है। पिछले आठ वर्षों में एकल-कण क्रायो-ईएम के लिए स्वचालित इमेजिंग के लिए कई स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज विकसित किए गए थे। यह पेपर कम खुराक की स्थिति के तहत vitrified biomolecules के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित छवि अधिग्रहण पाइपलाइन का एक आवेदन प्रस्तुत करता है।
यह एक सॉफ़्टवेयर पैकेज को प्रदर्शित करता है, जो क्रायो-ईएम डेटा को पूरी तरह से, स्वचालित रूप से और सटीक रूप से एकत्र कर सकता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न माइक्रोस्कोपिक पैरामीटर आसानी से इस सॉफ़्टवेयर पैकेज द्वारा नियंत्रित किए जाते हैं। यह प्रोटोकॉल गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम-कोरोनोवायरस 2 (SARS-CoV-2) स्पाइक प्रोटीन के स्वचालित इमेजिंग में इस सॉफ़्टवेयर पैकेज की क्षमता को प्रदर्शित करता है, जिसमें एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर (डीईडी) से सुसज्जित 200 केवी क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप होता है। डेटा संग्रह के एक सत्र (48 ज) में लगभग 3,000 क्रायो-ईएम फिल्म छवियों का अधिग्रहण किया गया था, जिससे सार्स-कोव -2 के स्पाइक प्रोटीन की परमाणु-रिज़ॉल्यूशन संरचना उत्पन्न हुई थी। इसके अलावा, यह संरचनात्मक अध्ययन इंगित करता है कि स्पाइक प्रोटीन दो प्रमुख संरचनाओं को अपनाता है, 1-आरबीडी (रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन) खुले और सभी आरबीडी बंद संरचनाओं को नीचे।
Introduction
एकल कण क्रायो-ईएम जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स 1 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए एक मुख्यधारा की संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक बन गई है। एकल-कण पुनर्निर्माण दो-आयामी (2 डी) कण छवियों को निकालने के लिए विट्रीफाइड नमूनों के माइक्रोग्राफ की एक विशाल संख्या प्राप्त करने पर निर्भर करता है, जिसका उपयोग तब जैविक मैक्रोमोलेक्यूल 2,3 की तीन आयामी (3 डी) संरचना के पुनर्निर्माण के लिए किया जाता है। डीईडी के विकास से पहले, एकल-कण पुनर्निर्माण से प्राप्त संकल्प 4 और 30 Å4,5 के बीच था। हाल ही में, एकल कण क्रायो-ईएम से प्राप्त करने योग्य संकल्प 1.8 Å6 से परे पहुंच गया है। डीईडी और स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर इस संकल्प क्रांति 7 में प्रमुख योगदानकर्ता रहे हैं, जहां डेटा संग्रह के लिए मानव हस्तक्षेप न्यूनतम है। आम तौर पर, क्रायो-ईएम इमेजिंग जैविक नमूनों के इलेक्ट्रॉन बीम-प्रेरित विकिरण क्षति को कम करने के लिए कम इलेक्ट्रॉन खुराक दरों (20-100 ई / Å2) पर किया जाता है, जो छवि में कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) में योगदान देता है। यह कम एसएनआर एकल-कण विश्लेषण का उपयोग करके जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं के लक्षण वर्णन को बाधित करता है।
नई पीढ़ी के इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर CMOS (पूरक धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक) -आधारित डिटेक्टर हैं, जो इन कम एसएनआर से संबंधित बाधाओं को दूर कर सकते हैं। ये प्रत्यक्ष पहचान CMOS कैमरे सिग्नल के तेजी से रीडआउट की अनुमति देते हैं, जिसके कारण कैमरा जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के लिए बेहतर बिंदु प्रसार समारोह, उपयुक्त एसएनआर और उत्कृष्ट जासूस क्वांटम दक्षता (डीक्यूई) में योगदान देता है। प्रत्यक्ष पहचान कैमरे रिकॉर्ड की गई छवियों में उच्च एसएनआर 8 और कम शोर प्रदान करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप जासूस क्वांटम दक्षता (डीक्यूई) में मात्रात्मक वृद्धि होती है – एक डिटेक्टर एक छवि में कितना शोर जोड़ता है, इसका एक उपाय। ये कैमरे सैकड़ों फ्रेम प्रति सेकंड की गति से फिल्में भी रिकॉर्ड करते हैं, जो तेजी से डेटा अधिग्रहण 9,10 को सक्षम बनाता है। ये सभी विशेषताएं कम खुराक वाले अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त तेजी से प्रत्यक्ष पहचान कैमरों को बनाती हैं।
मोशन-सही स्टैक छवियों का उपयोग डेटा प्रोसेसिंग के लिए 2 डी वर्गीकरण की गणना करने और विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेजों जैसे RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14, और EMAN215 का उपयोग करके मैक्रोमोलेक्यूल्स के 3 डी घनत्व मानचित्र का पुनर्निर्माण करने के लिए किया जाता है। हालांकि, एकल-कण विश्लेषण के लिए, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करने के लिए एक विशाल डेटासेट की आवश्यकता होती है। इसलिए, स्वचालित डेटा अधिग्रहण टोल डेटा संग्रह के लिए अत्यधिक आवश्यक हैं। बड़े क्रायो-ईएम डेटा सेट रिकॉर्ड करने के लिए, पिछले एक दशक में कई सॉफ़्टवेयर पैकेजों का उपयोग किया गया है। समर्पित सॉफ़्टवेयर पैकेज, जैसे AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS, और EPU, स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए विकसित किए गए हैं।
ये सॉफ़्टवेयर पैकेज नियमित कार्यों का उपयोग करते हैं ताकि कम-आवर्धन छवियों को उच्च-आवर्धन छवियों से जोड़कर स्वचालित रूप से छेद की स्थिति को ढूंढा जा सके, जो कम खुराक की स्थिति के तहत छवि अधिग्रहण के लिए एप्रोप्रेटिव बर्फ की मोटाई के विट्रियस बर्फ के साथ छेद की पहचान करने में सहायता करता है। इन सॉफ़्टवेयर पैकेजों ने दोहराए जाने वाले कार्यों की संख्या को कम कर दिया है और क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के थ्रूपुट को कई दिनों तक लगातार कई दिनों तक अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा की एक विशाल मात्रा प्राप्त करके, बिना किसी रुकावट और ऑपरेटर की भौतिक उपस्थिति के बढ़ा दिया है। अक्षांश-एस एक समान सॉफ्टवेयर पैकेज है, जिसका उपयोग एकल-कण विश्लेषण के लिए स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए किया जाता है। हालांकि, यह सॉफ़्टवेयर पैकेज केवल K2/K3 DEDs के लिए उपयुक्त है और इन डिटेक्टरों के साथ प्रदान किया जाता है।
यह प्रोटोकॉल सार्स-कोव-2 स्पाइक प्रोटीन के स्वचालित छवि अधिग्रहण में अक्षांश-एस की क्षमता को दर्शाता है, जिसमें 200 केवी क्रायो-ईएम से लैस एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर होता है ( सामग्री की तालिका देखें)। इस डेटा संग्रह उपकरण का उपयोग करते हुए, SARS-CoV-2 स्पाइक प्रोटीन की 3,000 मूवी फ़ाइलों को स्वचालित रूप से अधिग्रहित किया जाता है, और 3.9-4.4 Å रिज़ॉल्यूशन स्पाइक प्रोटीन संरचना प्राप्त करने के लिए आगे डेटा प्रोसेसिंग की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अक्षांश-एस एक सहज उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस है, जो स्वचालित रूप से स्थापित करने और दो दिनों में हजारों उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोग्राफ या मूवी फ़ाइलों को इकट्ठा करने के लिए एक वातावरण प्रदान करता है। यह ग्रि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जैव प्रौद्योगिकी विभाग, विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (डीएसटी) और विज्ञान विभाग और मानव संसाधन विकास मंत्रालय (एमएचआरडी), भारत को आईआईएससी-बैंगलोर में वित्त पोषण और क्रायो-ईएम सुविधा के लिए स्वीकार करते हैं। हम आईआईएससी, बैंगलोर में राष्ट्रीय क्रायो-ईएम सुविधा के लिए डीबीटी-बिल्डर प्रोग्राम (बीटी / आईएनएफ / 22 / एसपी 22844 /2017) और डीएसटी-फिस्ट (एसआर / एफएसटी / एलएसआईआई -039 / 2015) को स्वीकार करते हैं। हम विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड (SERB) (अनुदान संख्या-SB/ S2/ RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 और SERB-IPA/2020/000094), DBT (अनुदान संख्या 145/2015) से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं। BT/PR25580/BRB/10/1619/2017)। हम क्रायो-ईएम ग्रिड, क्रायो-ईएम डेटा संग्रह तैयार करने और सामग्री की तालिका तैयार करने के लिए सुश्री इशिका प्रमानिक को धन्यवाद देते हैं। हम क्रायो-ईएम छवि प्रसंस्करण के लिए और आंकड़े तैयार करने में हमारी मदद करने के लिए श्री सुमन मिश्रा को भी धन्यवाद देते हैं। हम इस अध्ययन के लिए शुद्ध स्पाइक प्रोटीन नमूना प्राप्त करने में हमारी मदद करने के लिए प्रोफेसर राघवन वरदराजन को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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