Enpartikkel kryo-elektronmikroskopi krever en passende programvarepakke og brukervennlig rørledning for automatisk datainnsamling med høy gjennomstrømning. Her presenterer vi anvendelsen av en helautomatisk programvarepakke for bildeinnhenting, Latitude-S, og en praktisk rørledning for datainnsamling av vitrifiserte biomolekyler under lavdoseforhold.
I løpet av de siste årene har teknologiske og metodologiske fremskritt innen enpartikkel cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) banet en ny vei for høyoppløselig strukturbestemmelse av biologiske makromolekyler. Til tross for de bemerkelsesverdige fremskrittene i cryo-EM, er det fortsatt rom for forbedring i ulike aspekter av arbeidsflyten for enkeltpartikkelanalyse. Enkeltpartikkelanalyse krever en passende programvarepakke for automatisk datainnsamling med høy gjennomstrømning. Flere automatiske programvarepakker for datainnsamling ble utviklet for automatisk avbildning for enpartikkel cryo-EM de siste åtte årene. Dette dokumentet presenterer en anvendelse av en helautomatisk bildeinnsamlingspipeline for vitrifiserte biomolekyler under lavdoseforhold.
Den demonstrerer en programvarepakke, som kan samle kryo-EM-data fullt ut, automatisk og presist. I tillegg kontrolleres forskjellige mikroskopiske parametere enkelt av denne programvarepakken. Denne protokollen demonstrerer potensialet i denne programvarepakken i automatisert avbildning av det alvorlige akutte respiratoriske syndromet-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike protein med et 200 keV kryo-elektronmikroskop utstyrt med en direkte elektrondetektor (DED). Rundt 3000 cryo-EM-filmbilder ble anskaffet i en enkelt økt (48 t) datainnsamling, noe som gir en atomoppløsningsstruktur av piggproteinet til SARS-CoV-2. Videre indikerer denne strukturelle studien at piggproteinet vedtar to store konformasjoner, 1-RBD (reseptorbindende domene) opp åpne og alle RBD ned lukkede konformasjoner.
Single-particle cryo-EM har blitt en vanlig strukturell biologi teknikk for høyoppløselig struktur bestemmelse av biologiske makromolekyler1. Enkeltpartikkelrekonstruksjon avhenger av å skaffe seg et stort antall mikrografer av vitrifiserte prøver for å trekke ut todimensjonale (2D) partikkelbilder, som deretter brukes til å rekonstruere en tredimensjonal (3D) struktur av en biologisk makromolekyl2,3. Før utviklingen av DEDs varierte oppløsningen fra enkeltpartikkelrekonstruksjon mellom 4 og 30 Å4,5. Nylig har den oppnåelige oppløsningen fra single-particle cryo-EM nådd utover 1,8 Å6. DED og automatisert datainnsamlingsprogramvare har vært viktige bidragsytere til denne oppløsningsrevolusjonen7, der menneskelig intervensjon for datainnsamling er minimal. Generelt utføres kryo-EM-avbildning ved lave elektrondosehastigheter (20-100 e/Å2) for å minimere elektronstråleindusert strålingsskade av biologiske prøver, noe som bidrar til det lave signal-til-støy-forholdet (SNR) i bildet. Denne lave SNR hindrer karakteriseringen av høyoppløselige strukturer av biologiske makromolekyler ved hjelp av enkeltpartikkelanalyse.
Den nye generasjonen elektrondetektorer er CMOS (komplementære metalloksid-halvleder)-baserte detektorer, som kan overvinne disse lave SNR-relaterte hindringene. Disse direkte deteksjon CMOS-kameraene tillater rask avlesning av signalet, på grunn av hvilket kameraet bidrar til bedre punktspredningsfunksjon, egnet SNR og utmerket detektiv kvanteeffektivitet (DQE) for biologiske makromolekyler. Direkte deteksjonskameraer tilbyr høy SNR8 og lav støy i de innspilte bildene, noe som resulterer i en kvantitativ økning i detektiv kvanteeffektivitet (DQE) – et mål på hvor mye støy en detektor legger til et bilde. Disse kameraene tar også opp filmer med hastigheten på hundrevis av bilder per sekund, noe som muliggjør rask datainnsamling9,10. Alle disse egenskapene gjør raske direkte deteksjonskameraer egnet for lavdoseapplikasjoner.
Bevegelseskorrigerte stakkbilder brukes til databehandling for å beregne 2D-klassifisering og rekonstruere et 3D-tetthetskart over makromolekyler ved hjelp av ulike programvarepakker som RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 og EMAN215. For enkeltpartikkelanalyse er det imidlertid nødvendig med et enormt datasett for å oppnå en høyoppløselig struktur. Derfor er automatisk datainnsamlingsavgift svært viktig for datainnsamling. For å registrere store cryo-EM-datasett har flere programvarepakker blitt brukt det siste tiåret. Dedikerte programvarepakker, for eksempel AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS og EPU, er utviklet for automatisert datainnsamling.
Disse programvarepakkene bruker rutinemessige oppgaver for å finne hullposisjoner automatisk ved å korrelere bildene med lav forstørrelse til bilder med høy forstørrelse, som hjelper til med å identifisere hull med glassaktig is av appropriativ istykkelse for bildeanskaffelse under lavdoseforhold. Disse programvarepakkene har redusert antall repeterende oppgaver og økt gjennomstrømningen av cryo-EM-datainnsamlingen ved å skaffe seg en enorm mengde data av god kvalitet i flere dager kontinuerlig, uten avbrudd og den fysiske tilstedeværelsen til operatøren. Latitude-S er en lignende programvarepakke, som brukes til automatisk datainnsamling for enkeltpartikkelanalyse. Denne programvarepakken er imidlertid bare egnet for K2/ K3 DEDs og er utstyrt med disse detektorene.
Denne protokollen demonstrerer potensialet til Latitude-S i den automatiserte bildeinnhentingen av SARS-CoV-2 spikeprotein med en direkte elektrondetektor utstyrt med en 200 keV cryo-EM (se materialtabellen). Ved hjelp av dette datainnsamlingsverktøyet blir 3000 filmfiler av SARS-CoV-2 spike protein automatisk anskaffet, og ytterligere databehandling utføres for å oppnå en 3,9-4,4 Å oppløsning spike proteinstruktur.
Latitude-S er et intuitivt brukergrensesnitt som gir et miljø der du automatisk kan sette opp og samle tusenvis av mikrografer eller filmfiler med høy oppløsning på to dager. Det gir enkel navigering på tvers av rutenettene og opprettholder plasseringen av mikroskopstadiet mens det beveger seg fra lav forstørrelse til høy forstørrelse. Hvert trinn i datainnsamlingen med Latitude-S er tidseffektiv, med funksjoner som et enkelt brukergrensesnitt, rask strømming av data med hastighet på opptil 4,5 GB/s og samtidig…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Institutt for bioteknologi, Institutt for vitenskap og teknologi (DST) og vitenskap, og Departementet for personalutvikling (MHRD), India, for finansiering og cryo-EM-anlegget ved IISc-Bangalore. Vi anerkjenner DBT-BUILDER Program (BT / INF / 22 / SP22844 / 2017) og DST-FIST (SR / FST / LSII-039 / 2015) for National Cryo-EM anlegget på IISc, Bangalore. Vi anerkjenner økonomisk støtte fra Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 og SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Vi takker Ms. Ishika Pramanick for å forberede cryo-EM-rutenett, kryo-EM-datainnsamling og utarbeide materialtabellen. Vi takker også Mr. Suman Mishra for kryo-EM bildebehandling og for å hjelpe oss med å forberede tallene. Vi takker prof. Raghavan Varadarajan for å hjelpe oss med å få den rensede piggproteinprøven for denne studien.
Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |