Confocal माइक्रोस्कोप इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से बाह्य कोशिकीय पुटिका अपटेक परख
Summary
बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं (ईवी) सेलुलर जीव विज्ञान और अंतरकोशिकीय संचार में योगदान करती हैं। कोशिकाओं द्वारा ईवी एस अपटेक की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यावहारिक assays की आवश्यकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक नैनो निस्पंदन आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस द्वारा ईवी अलगाव के बाद, confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से तीन आयामी प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके ईवी अपटेक परख का प्रस्ताव करता है।
Abstract
कोशिकाओं के बाह्य कोशिकीय पुटिका (ईवी) अपटेक की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यावहारिक assays की आवश्यकता है। ईवी अपटेक विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में अंतरकोशिकीय संचार में एक भूमिका निभाता है; कैंसर जीव विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान, और दवा वितरण। साहित्य में कई ईवी अपटेक एसेस की सूचना दी गई है; हालांकि, व्यावहारिक, विस्तृत प्रयोगात्मक पद्धति की कमी है। ईवी अपटेक का मूल्यांकन कोशिकाओं के भीतर उनके स्थान का पता लगाने के लिए ईवी को फ्लोरोसेंटली लेबल करके किया जा सकता है। कोशिकाओं में आंतरिक ईवी और कोशिकाओं पर सतही ईवी के बीच अंतर करना मुश्किल है, फिर भी महत्वपूर्ण है, ईवी अपटेक को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए। इसलिए, एक परख है कि कुशलतासे तीन आयामी (3 डी) प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से EV uptake quantifies इस काम में प्रस्तावित है. फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी को नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके तैयार किया गया था, जिसे 3 डी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई थी, और फिर उन्नत छवि-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। प्रोटोकॉल एक सेलुलर स्तर पर ईवी का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत पद्धति और कुशल विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Introduction
बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं (ईवी) नैनो-आकार, लिपिड झिल्ली-बाध्य कण हैं जिन्हें उनके आकारों द्वारा वर्गीकृत किया जाता है: एक्टोसोम (100-500 एनएम) और एक्सोसोम (50-150 एनएम)1। ईवी में विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स होते हैं, जैसे प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड। ये बायोमोलेक्यूल्स कार्गो के रूप में encapsulated होने से पहले कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं और EVs1,2,3 के माध्यम से बाह्य कोशिकीय अंतरिक्ष में जारी किए जाते हैं।
उनके कार्गो की विविधता के कारण, ईवी एस को अंतरकोशिकीय संचार में सक्रिय भूमिका निभाने के लिए माना जाता है। कोशिकाओं द्वारा ईवी की रिहाई और उत्थान कोशिकाओं के बीच बायोमोलेक्यूल्स के हस्तांतरण की अनुमति देता है4,5। एक सेल के लिए ईवी कार्गो की शुरूआत प्राप्तकर्ता सेल के कार्यों और होमोस्टैटिक स्टेट 4,5,6 को बदल सकती है। ईवी को कई मार्गों के माध्यम से आंतरिक किया जाता है; हालांकि, सटीक तंत्र को सटीक रूप से प्रदर्शित नहीं किया गया है।
ईवी अपटेक एसेस के बहुमत, जैसे कि आनुवंशिक टैगिंग, फ्लोरोसेंटली लेबल व्यक्तिगत ईवी 7। परिणामी संकेत को माइक्रोप्लेट फोटोमीटर, फ्लो साइटोमेट्री, या माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जा सकता है, जिसमें प्रत्येक तकनीक की पर्याप्त सीमाएं होती हैं। माइक्रोप्लेट फोटोमीटर, फ्लो साइटोमेट्री, या मानक दो-आयामी (2 डी) माइक्रोस्कोपी आंतरिक और सतही रूप से संलग्न ईवी 8, 9 के बीच अंतर नहीं कर सकती है। इसके अतिरिक्त, इन तकनीकों में से प्रत्येक के लिए आवश्यक नमूना तैयारी EV uptake मूल्यांकन के लिए अतिरिक्त मुद्दों को पेश कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, ईवी अपटेक विश्लेषण से पहले ट्रिप्सिन के साथ चिपके हुए कोशिकाओं को उठाने से सेल की सतह 10,11 पर कुछ सतही रूप से संलग्न ईवी को क्लीव किया जा सकता है। ट्रिप्सिन सेल सतह के साथ भी बातचीत कर सकता है, सेल और ईवी फेनोटाइप को प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, ट्रिप्सिन सतही ईवी को पूरी तरह से अलग नहीं कर सकता है, अलग-थलग आबादी को तिरछा कर सकता है।
फ्लोरोसेंट रंगों के साथ ईवी को सटीक रूप से लेबल करने के लिए, अवशिष्ट डाई 7 को हटाने के लिए अतिरिक्त धोने के चरणों की आवश्यकता होती है। स्वीकृत अलगाव तकनीकें भी जमावट के कारण झूठे-सकारात्मक संकेतों में योगदान कर सकती हैं जो ईवी अलगाव के दौरान होती हैं। उदाहरण के लिए, सीरियल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (यूसी) का उपयोग व्यापक रूप से ईवी को अलग करने और स्थिर डाई को हटाने के लिए किया जाता है। हालांकि, यूसी ईवी को सह-अवक्षेपित कर सकता है, और अवशिष्ट डाई एक गलत-सकारात्मक संकेत 12,13 का कारण बन सकता है। अन्य नैनो-निस्पंदन विधियों, जैसे स्तंभ-आधारित निस्पंदन, का उपयोग गैर-स्थिर डाई हटाने के लिए भी व्यापक रूप से किया जाता है। ईवी और स्तंभ मैट्रिक्स के भीतर बातचीत करने वाले डाई की जटिल प्रकृति जटिल इनपुट 14,15,16 द्वारा परिवर्तित किए जा रहे स्तंभ के आणविक कट-ऑफ के कारण अवशिष्ट डाई के अधूरे हटाने का कारण बन सकती है।
वर्तमान प्रोटोकॉल एक नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का प्रस्ताव करता है जो फ्लोरोसेंटली लेबल वाले अलग-अलग ईवी को अलग करने और धोने के लिए है। नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस द्रव-सहायता प्राप्त पृथक्करण प्रौद्योगिकी (फास्ट) 17,18 के माध्यम से कुशल निस्पंदन प्रदान कर सकता है। फास्ट फिल्टर भर में दबाव ड्रॉप को कम करता है, इस प्रकार ईवी और रंजक के बीच संभावित एकत्रीकरण को कम करता है। कुशलतासे अवशिष्ट डाई को हटाने से, फ्लोरोसेंटली लेबल ईवी की गुणवत्ता और परख की विशिष्टता को बढ़ाना संभव है।
Confocal माइक्रोस्कोपी सेल की सतह पर आंतरिक और सतही रूप से संलग्न ईवी के बीच अंतर कर सकती है और व्यापक रूप से एक स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन 19,20,21,22,23,24,25 में ईवी अपटेक के सेलुलर तंत्र की जांच कर सकती है। उदाहरण के लिए, सुंग एट अल ने अपने विकसित लाइव-सेल रिपोर्टर का उपयोग करके एक्सोसोम जीवनचक्र के विज़ुअलाइज़ेशन का वर्णन किया। आंतरिक ईवी के स्थान का पता लगाया गया था और तीन आयाम (3 डी) और पोस्ट-इमेज प्रोसेसिंग टूल20 में एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। हालांकि छोटे ईवी (40-200 एनएम) का आकार ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की रिज़ॉल्यूशन सीमा से नीचे है, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है क्योंकि फोटोडिटेक्टर बढ़ाया प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगा सकता है। इसलिए, एक सेल के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को ईवी और आसपास के सेलुलर ऑर्गेनेल की कई जेड-स्टैक्ड छवियों को प्राप्त करके ठीक से निर्धारित किया जा सकता है।
इसके अतिरिक्त, 3 डी पुनर्निर्माण और पोस्ट-डेटा प्रोसेसिंग आंतरिक, सतही और मुक्त-फ्लोटिंग ईवी की स्थिति में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पेश किए गए टाइम-लैप्स लाइव-सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में इन प्रक्रियाओं का उपयोग करके, ईवी अपटेक के स्तर का सटीक मूल्यांकन किया जा सकता है, और ईवी अपटेक का वास्तविक समय ट्रैकिंग भी संभव है। इसके अलावा, ईवी तस्करी विश्लेषण ऑर्गेनेल के साथ ईवी के सह-स्थानीयकरण का आकलन करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है, यह निर्धारित करने के लिए पहला कदम है कि आंतरिक ईवी इंट्रासेल्युलर फ़ंक्शन में कैसे शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 17,26, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और पोस्ट-इमेज विश्लेषण का उपयोग करके एक ईवी अपटेक परख करने के लिए पद्धति का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 3 डी प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर आधारित एक ईवी अपटेक परख एक कुशल पद्धति और संवेदनशील विश्लेषण प्रदान करता है। इस फ्लोरोसेंट ईवी लेबलिंग EVs के विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा देत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को NCI अनुदान संख्याओं द्वारा समर्थित किया गया था। U54CA143803, CA163124, CA093900, और CA143055 के लिए K. J. P. इस शोध को कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (KHIDI) के माध्यम से कोरिया स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान और विकास परियोजना के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे स्वास्थ्य और कल्याण मंत्रालय, कोरिया गणराज्य (अनुदान संख्या: HI19C1122) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जे किम और वाई-के द्वारा काम। चो को बुनियादी विज्ञान संस्थान (IBS-R020-D1) द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे कोरियाई सरकार द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखकों ने ब्रैडी यूरोलॉजिकल इंस्टीट्यूट के वर्तमान और पिछले सदस्यों को धन्यवाद दिया, विशेष रूप से पिएंटा-संशोधन प्रयोगशाला के सदस्यों को पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धन्यवाद दिया।
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
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