Ekstracellulær vesicle opptak analyse via confocal mikroskop imaging analyse
Summary
Ekstracellulære vesicles (ELBILER) bidrar til cellulær biologi og intercellulær kommunikasjon. Det er behov for praktiske analyser for å visualisere og kvantifisere elbiler opptak av cellene. Den nåværende protokollen foreslår EV-opptaksanalysen ved å bruke tredimensjonal fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi, etter EV-isolasjon av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet.
Abstract
Det er behov for praktiske analyser for å visualisere og kvantifisere cellenes ekstracellulære vesicle (EV) opptak. EV-opptak spiller en rolle i intercellulær kommunikasjon på ulike forskningsfelt; kreftbiologi, nevrovitenskap og legemiddellevering. Mange EV-opptaksanalyser er rapportert i litteraturen; Det er imidlertid mangel på praktisk, detaljert eksperimentell metodikk. EV-opptak kan vurderes ved fluorescerende merking av elbiler for å oppdage deres plassering i celler. Det er vanskelig, men likevel kritisk å skille mellom internaliserte elbiler i celler og overfladiske elbiler på celler, men likevel kritisk, for å nøyaktig bestemme EV-opptaket. Derfor foreslås en analyse som effektivt kvantifiserer EV-opptak gjennom tredimensjonal (3D) fluorescens konfektmikroskopi i dette arbeidet. Fluorescerende merkede elbiler ble tilberedt ved hjelp av en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet, visualisert av 3D-konfokal mikroskopi, og deretter analysert gjennom avansert bildebehandlingsprogramvare. Protokollen gir en robust metodikk for å analysere elbiler på cellenivå og en praktisk tilnærming for effektiv analyse.
Introduction
Ekstracellulære vesicles (ELBILER) er nano-størrelse, lipid membranbundne partikler som er kategorisert etter deres størrelser: ektosomer (100-500 nm) og eksosomer (50-150 nm)1. Elbiler inneholder ulike biomolekyler, som proteiner, nukleinsyrer og lipider. Disse biomolekylene stammer fra cellene før de blir innkapslet som last og sluppet ut i det ekstracellulære rommet via elbiler1,2,3.
På grunn av mangfoldet av lasten antas elbiler å spille en aktiv rolle i intercellulær kommunikasjon. Frigjøring og opptak av elbiler etter celler tillater overføring av biomolekyler mellom cellene4,5. Innføringen av EV-last til en celle kan endre mottakercellens funksjoner og homeostatisk tilstand4,5,6. Elbiler internaliseres gjennom flere veier; De eksakte mekanismene er imidlertid ikke nøyaktig demonstrert.
Flertallet av EV-opptaksanalysene, som genetisk merking, merker fluorescerende individuelle elbiler7. Det resulterende signalet kan måles ved mikroplatefotometer, strømningscytometri eller mikroskopi, der hver teknologi har betydelige begrensninger. Mikroplatefotometre, strømningscytometri eller standard todimensjonal (2D) mikroskopi kan ikke skille mellom internalisert og overfladisk festet ELBILER8,9. I tillegg kan den nødvendige prøveforberedelsen for hver av disse teknikkene introdusere ytterligere problemer for EV-opptaksevaluering. For eksempel kan løfting av tilkoblede celler med trypsin før EV-opptaksanalysen spalte noen overfladisk festet elbiler på cellens overflate10,11. Trypsin kan også samhandle med celleoverflaten, som påvirker celle- og EV-fenotypen. I tillegg kan trypsin ikke løsne overfladiske elbiler helt, og forskyve isolerte populasjoner.
For å nøyaktig merke elbiler med fluorescerende fargestoffer, er det nødvendig med ytterligere vasketrinn for å fjerne gjenværende fargestoff7. Aksepterte isolasjonsteknikker kan også bidra til falske positive signaler på grunn av koagulasjon som oppstår under EV-isolasjon. For eksempel er seriell ultracentrifugation (UC) mye brukt til å isolere elbiler og fjerne det immobiliserte fargestoffet. UC kan imidlertid samtidig utfelle elbiler, og restfargen kan føre til et falskt positivt signal12,13. Andre nanofiltreringsmetoder, for eksempel kolonnebasert filtrering, er også mye brukt til ikke-immobilisert fargefjerning. Den komplekse naturen til elbiler og fargestoffer som samhandler innenfor kolonnematrisen, kan føre til ufullstendig fjerning av gjenværende fargestoff på grunn av molekylær avskjæring av kolonnen som endres av den komplekse inngangen14,15,16.
Den nåværende protokollen foreslår en nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet for å isolere og vaske fluorescerende merkede isolerte elbiler. Den nanofiltreringsbaserte mikrofluidiske enheten kan gi effektiv filtrering via væskeassistert separasjonsteknologi (FAST)17,18. FAST reduserer trykkfallet over filteret, og reduserer dermed potensiell aggregering mellom elbiler og fargestoffer. Ved å effektivt fjerne gjenværende fargestoff, er det mulig å forbedre kvaliteten på fluorescerende merkede elbiler og analysens spesifisitet.
Konfokal mikroskopi kan skille mellom internaliserte og overfladisk tilkoblede elbiler på celleoverflaten og undersøke de cellulære mekanismene for EV-opptak i en romlig oppløsning19,20,21,22,23,24,25. For eksempel beskrev Sung et al. visualiseringen av eksosomets livssyklus ved hjelp av deres utviklede live-celle reporter. Plasseringen av de internaliserte ELBIL-ene ble oppdaget og analysert ved hjelp av et konfokalt mikroskop i tredimensjonale (3D) og etterbildebehandlingsverktøy20. Selv om størrelsen på små elbiler (40-200 nm) er under oppløsningsgrensen for det optiske mikroskopet, kan de fluorescerende merkede ELBIL-ene oppdages ved konfektmikroskopi siden fotodetektoren kan oppdage det forbedrede fluorescensutslippet. Derfor kan den subcellulære lokaliseringen av fluorescerende merkede elbiler i en celle bestemmes nøyaktig ved å skaffe flere z-stablede bilder av ELBIL-ene og de omkringliggende cellulære organellene.
I tillegg kan 3D-rekonstruksjon og etterdatabehandling gi ytterligere innsikt i plasseringen av de internaliserte, overfladiske og frittflytende ELBIL-ene. Ved å bruke disse prosessene i forbindelse med tidsforløpet live-celle bildebehandling som tilbys av konfektmikroskopi, kan nivået av EV-opptak evalueres nøyaktig, og sanntidssporing av EV-opptak er også mulig. Videre kan EV trafficking analyse utføres ved hjelp av konfokal mikroskopi ved å vurdere samlokalisering av elbiler med organeller, et første skritt for å bestemme hvordan internaliserte elbiler er involvert i den intracellulære funksjonen. Denne protokollen beskriver metodikken for å utføre en EV-opptaksanalyse ved hjelp av nanofiltreringsbasert mikrofluidisk enhet17,26, konfikal mikroskopi og analyse etter bilde.
Protocol
Representative Results
Discussion
En EV-opptaksanalyse basert på 3D-fluorescensavbildning via konfikal mikroskopi gir en effektiv metodikk og sensitiv analyse. Denne fluorescerende EV-merkingen letter visualiseringen av elbiler og utfører vellykket en presis EV-opptaksanalyse. Tidligere metoder for merking av elbiler og fjerning av restfargestoffet er rapportert ved å fjerne nedbør ved hjelp av ultracentrifugation (UC); UC kan imidlertid samtidig utfelle elbiler, og det immobiliserte fargestoffet kan føre til et falskt positivt <sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NCI grant nos. U54CA143803, CA163124, CA093900 og CA143055 til K. J. P. Denne forskningen ble støttet av et tilskudd fra Korea Health Technology R&D Project gjennom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansiert av Departementet for helse og velferd, Republikken Korea (tilskuddsnummer: HI19C1122). Arbeid av J. Kim og Y.-K. Cho ble støttet av Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansiert av den koreanske regjeringen. Forfatterne takker nåværende og tidligere medlemmer av Brady Urological Institute, spesielt medlemmer av Pienta-Amend-laboratoriet, for den kritiske lesningen av manuskriptet.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-‘T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -. K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -. H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
