该方法的目标是在小鼠模型中筛查热疗或热诱发的癫痫发作。该协议描述了使用定制的腔室,连续监测体温,以确定体温升高是否会导致癫痫发作。
转基因小鼠模型已被证明是研究人类神经系统疾病各个方面(包括癫痫)的强大工具。 SCN1A 相关的遗传性癫痫包括广泛的癫痫发作疾病,具有不完全外显率和临床变异性。SCN1A 突变可导致多种癫痫发作表型,从简单的自限性发热相关性热性惊厥 (FS)、伴有热性惊厥的中度遗传性癫痫 (GEFS+) 到更严重的 Dravet 综合征 (DS)。虽然FS常见于6-7岁以下没有遗传性癫痫的儿童,但GEFS +患者中的FS继续发生到成年期。传统上,通过将动物暴露于干燥的空气流或加热灯,在小鼠中诱导了实验性FS,并且体温的变化率通常不能得到很好的控制。在这里,我们描述了一个定制的加热室,带有有机玻璃前部,配有数字温度控制器和配备加热器的电风扇,可以以温度控制的方式将加热的强制空气送入测试场地。通过直肠探头监测放置在腔室中的小鼠的体温可以通过增加腔室内的温度以可重复的方式增加到40-42°C。在加热期间对动物的持续视觉监测表明,在体温下携带FS突变的小鼠中热诱导的癫痫发作不会引发野生型窝伴侣的行为癫痫发作。动物可以很容易地从腔室中取出并放置在冷却垫上,以迅速将体温恢复到正常水平。该方法为癫痫小鼠模型中热诱导癫痫发作的发生提供了简单,快速且可重复的筛查方案。
癫痫是美国第四大最常见的神经系统疾病家族1,其特征在于中枢神经系统中兴奋性和抑制性驱动的不平衡,导致反复发作。热性惊厥(FS)或与发烧相关的癫痫发作可能发生在一般人群中,最常见于早在3个月到6-7岁的儿童中。然而,在一些具有基因突变的个体中,最常见的是钠通道基因,FS可以持续超过7岁直到成年期。这种情况被称为热性惊厥加或FS +。基因组测序的快速发展已经在人类钠离子通道基因 SCN1A中发现了1,300多个突变,使其成为癫痫突变的热点。SCN1A 突变与广泛的癫痫发作有关,包括热性惊厥(FS),伴有热性惊厥加(GEFS+)的遗传性癫痫和Dravet综合征(DS)2,3,4,5,6。大约20%的SCN1A错义突变导致GEFS +5,7,8。儿童期复杂或长期FS的儿科病史随后可发展成更虚弱的癫痫形式,如颞叶癫痫(TLE)9,10,11。Dravet 综合征是由于 SCN1A 中的截断突变或功能丧失而引起的,是一种严重的顽固性癫痫,伴有儿童期热性惊厥,发展为难治性癫痫发作,通常与认知、发育和运动障碍相关2,5,12.由于许多患有GEFS +和/或DS的个体表现出热性惊厥,因此开发新的疗法以更好地对抗这些癫痫发作变得势在必行。
SCN1A相关癫痫的动物模型已被证明在表征不同类型的癫痫发作(发热与全身性)和剖析癫痫发作产生的神经元机制方面具有无可估量的价值13,14,15,16,17,18。虽然通过EEG / EMG记录在啮齿动物大脑中自发性癫痫发作的研究已经建立起来,并且是一个非常有用的工具,但只有少数研究试图模仿小鼠模型中的热性惊厥14,16,19,20,21,22,23.以前的研究已经使用加热干燥空气的射流,或装有热系统的甲基丙烯酸酯圆筒,或在封闭的测试场所中使用带有温度控制器的加热灯9,16,21,22,23,24 通过热疗诱导癫痫发作。为了在更受控的环境中提高体温,这里描述的协议使用带有温度控制加热系统的定制室,允许室内小鼠体温的可重复增加速率。加热室由木材制成(长40厘米x宽34厘米x高31厘米),并配有带K热电偶的数字温度控制器。在腔室后面板上装有加热器的小型轴流风扇将加热的空气引导到由数字温度控制器调节的腔室中。这种强制空气加热系统使人们能够控制腔室温度升高的速率。(图1A、B)。位于木制加热室内部的K热电偶向数字温度控制器发送反馈,以在测定过程中保持盒子内部的恒定温度。在数字温度控制器上设置温度,使电风扇能够通过通风口发送加热的强制空气,以均匀加热腔室(图1A)。加热室的前面板是一块透明的有机玻璃板,可以轻松录制试验的视频。
每个实验都选择了成年(P30-P40)小鼠,杂合子,用于SCN1A中的错义突变,导致GEFS +和相同数量的野生型幼崽作为对照组。在这些研究中使用的动物,包括雄性和雌性,体重至少为15克,因为体重较小的野生型小鼠比同龄的较重动物对热诱发的癫痫发作更敏感。在试点研究中,观察到突变型和野生型小鼠在后面寻找腔室的凉爽角落,并在那里停留很长时间。为了规避这种情况,通过将木块B(尺寸20厘米x 8厘米x 7.2厘米)放在试验室右侧,将加热室测试场内的有效地板尺寸减少到16.5厘米x宽21.5厘米x高27.5厘米(图1A)。加热室由1.9厘米厚的胶合板(长40厘米x宽34厘米x高31厘米)制成,覆盖有白色层压板,并配有带K热电偶的数字温度控制器。腔室壁的层压板表面不透水,可以通过用70%乙醇擦拭在试验之间轻松消毒。加热室的温度最初设定为50°C,并在实验开始前预热至少1小时,以确保在室内均匀加热。每只小鼠都装有直肠温度计,用于在整个实验过程中连续监测体温。一次将一只小鼠放入腔室中,并在第1-10分钟之间将温度保持在50°C。然后将温度升高到55°C第11-20分钟,最后在第21-30分钟升至60°C。这导致小鼠体温的可重复增加速率(图2A)。每次试验都进行了录像,并离线进行了行为分析。
可以很容易地修改加热方案以改变加热室的初始温度和室的加热速率,这反过来又改变了测定过程中小鼠体温升高的速度。因此,与传统方法相比,该方法在设置涉及热诱发癫痫发作的行为筛查方面提供了更大的灵活性。热诱导癫痫发作方案也可用于筛选抗癫痫药物,使突变小鼠对热诱导的癫痫发作更具抵抗力或增加观察癫痫发作的阈值温度。同样,限制性饮食方案(如生酮饮食)对热诱导的癫痫发作的有益影响可以在正常chow喂养与生酮喂养的小鼠中检查。
图 1:定制鼠标加热室的说明。(A) 木制鼠标加热室的前面板显示了包含电源开/关开关的侧面控制面板,该开关可打开数字温度控制器、K 热电偶、风扇加热器的开/关开关和热量指示器。盒子的外部尺寸和内部测试竞技场以厘米为单位显示。还显示了用于有效减少测试竞技场表面的木块B。测试竞技场的底部覆盖着玉米棒垫料,以防止老鼠直接接触加热的木制表面。(B)加热室的后面板显示安装在顶部通风口上的风扇和电源线,以向加热室供电。该数字根据Das等人,2021,eNeuro14中的图3进行了修改。请点击此处查看此图的放大版本。
我们描述了一种简单有效的方案来筛查小鼠中热诱发的癫痫发作的发生,其行为相当于人类患者的热性惊厥。该测定评估几个参数 – 包括显示癫痫发作的小鼠百分比,癫痫发作阈值,拉辛量表上癫痫发作的严重程度,以比较对照和测试小鼠组对体温升高的敏感性。
该协议中的一个关键步骤涉及增加腔室中的热量,同时持续监测小鼠的体温。在这些测定中,小鼠将经历的最高体温必须为44°C,因为野生型动物可以在体温>44°C时经历热诱导的癫痫发作。 全身麻醉或镇痛药预处理可能会降低动物的核心体温或干扰体温调节,这反过来又会混淆癫痫发作阈值温度数据收集。因此,在30分钟的试验窗口内,不能为该筛选方案下的小鼠提供这些试剂。所有程序必须得到该机构IACUC委员会的批准。为了确保在测定过程中连续监测小鼠的核心体温,请将直肠温度探针牢固地贴在小鼠的尾巴上。如果在测定过程中,即使在增加小鼠腔室的温度后,发现小鼠体温仍长时间保持不变,请确保直肠温度探针没有从小鼠中出来或松散地附着在尾巴上。
小鼠模型的遗传背景可以影响对SCN1A突变和药理学诱导的癫痫发作的敏感性18,25,26,27。如上述结果所述,小鼠的遗传背景会影响它们对热诱导的癫痫发作的易感性。 Scn1a K1270T GEFS +突变小鼠在两种遗传背景 – 129X1和B6NJ中进行测试,并且在癫痫发作敏感的B6NJ背景下,一小部分野生型小鼠(33%)也被观察到经历热诱导的癫痫发作。然而,与杂合子突变体 Scn1aKT / + 小鼠相比,B6NJ野生型小鼠在显着更高的温度阈值下经历了热诱导的癫痫发作。这证实了CRISPR敲入引入的基因突变(Scn1a K1270T)使突变小鼠更容易受到体温过高诱导的癫痫发作的影响。
采用此协议有几个优点,总结如下。首先,与使用干燥空气流或加热灯不同,在封闭空间内设置的温度控制强制空气为实验者提供了对以所需速率加热测试竞技场的更多控制。加热方案中的步骤可以很容易地修改,以增加/减少起始温度,每个步骤的持续时间等,以筛选更重或更大的啮齿动物(如大鼠)的老年小鼠。其次,通过连接的直肠探针连续监测小鼠体温,在整个测定过程中提供有关个体小鼠体温变化速率的宝贵信息。这使得实验者能够密切观察小鼠的温度变化率不超过0.25-0.5°C / min(这对动物来说可能是有压力的),当将此方案应用于其他测试领域时。重要的是,不同小鼠组随时间变化的体温变化率可以揭示它们的体温调节能力,并且可能有助于了解引起突变的热性惊厥是否也改变了小鼠的体温调节。第三,连续体温监测确保使用此方案的癫痫发作阈值温度测量是准确的,因为它们与小鼠经历的第一次癫痫发作同时记录。如果在将动物带出试验场后没有连续监测动物的体温或测量癫痫发作阈值温度,则癫痫发作阈值可能会因癫痫发作后处理小鼠所花费的时间而变化。最后,这种方法避免了使用侵入性方法在小鼠中诱导发烧(通过注射病原体)以模仿人类患者的热性惊厥的需要。
该协议的局限性之一是很难筛查幼年(年龄小于P30)小鼠的热诱导癫痫发作。该协议旨在筛查成年小鼠(P30-P40及以上)对热或高热诱导的癫痫发作的敏感性。根据我们的经验,年轻的野生型小鼠,特别是那些体重低于15克的小鼠,更有可能经历热诱导的癫痫发作,这可能是由于不发达的体温调节机制,生理热应激或两者兼而有之。因此,使用该协议对幼年小鼠进行热诱导的癫痫发作筛查并不理想。
未来的研究结合了脑电图监测,同时将小鼠置于热诱发的癫痫发作中,可以揭示热诱发癫痫发作的脑电图癫痫发作模式,类似于以前的研究19。通过结合光遗传学方法和收获脑组织后基于免疫组织化学的研究,可以追踪小鼠大脑中特定区域的神经元活动。此外,限制性饮食(如生酮饮食)对减少热性惊厥的影响可以通过对生酮喂养的小鼠和正常chow喂养的小鼠进行热诱导的癫痫发作方案来评估。同样,可以开发癫痫药物筛选范例来测试和鉴定与载体喂养或对照小鼠相比,在药物喂养或治疗的小鼠中改善或抑制热诱导癫痫发作的候选抗癫痫药物。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢Connor J. Smith在构建定制的鼠标热室方面的帮助。我们感谢O’Dowd实验室成员Lisha Zeng和Andrew Salgado在测定开发的早期阶段标准化加热方案的帮助。我们还感谢Danny Benavides和Kumar Perinbam为手稿录制了部分实验过程。这项工作得到了NIH授予D.O.D.的赠款(NS083009)的支持。
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