Ziel der Methode ist es, in Mausmodellen auf Hyperthermie oder hitzeinduzierte Anfälle zu screenen. Das Protokoll beschreibt die Verwendung einer speziell angefertigten Kammer mit kontinuierlicher Überwachung der Körpertemperatur, um festzustellen, ob eine erhöhte Körpertemperatur zu Anfällen führt.
Transgene Mausmodelle haben sich als leistungsfähige Werkzeuge bei der Untersuchung verschiedener Aspekte menschlicher neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie, erwiesen. Die SCN1A-assoziierten genetischen Epilepsien umfassen ein breites Spektrum von Anfallsleiden mit unvollständiger Penetranz und klinischer Variabilität. SCN1A-Mutationen können zu einer Vielzahl von Anfallsphänotypen führen, die von einfachen, selbstlimitierten fieberassoziierten Fieberanfällen (FS), moderater genetischer Epilepsie mit Fieberkrämpfen plus (GEFS +) bis hin zum schwereren Dravet-Syndrom (DS) reichen. Obwohl FS häufig bei Kindern unter 6-7 Jahren beobachtet wird, die keine genetische Epilepsie haben, tritt FS bei GEFS + -Patienten weiterhin bis ins Erwachsenenalter auf. Traditionell wurden experimentelle FS bei Mäusen induziert, indem das Tier einem Strom trockener Luft oder Heizlampen ausgesetzt wurde, und die Änderungsrate der Körpertemperatur ist oft nicht gut kontrolliert. Hier beschreiben wir eine speziell angefertigte Heizkammer mit Plexiglasfront, die mit einem digitalen Temperaturregler und einem mit einer Heizung ausgestatteten elektrischen Ventilator ausgestattet ist, der erwärmte Zwangsluft temperaturgesteuert in die Testarena leiten kann. Die Körpertemperatur einer Maus, die in der Kammer platziert und durch eine rektale Sonde überwacht wird, kann reproduzierbar auf 40-42 ° C erhöht werden, indem die Temperatur in der Kammer erhöht wird. Die kontinuierliche visuelle Überwachung der Tiere während der Erhitzungszeit zeigt die Induktion von hitzeinduzierten Anfällen bei Mäusen, die eine FS-Mutation bei einer Körpertemperatur tragen, die bei Wildtyp-Wurfpartnern keine Verhaltensanfälle hervorruft. Tiere können leicht aus der Kammer entfernt und auf ein Kühlkissen gelegt werden, um die Körpertemperatur schnell wieder zu normalisieren. Diese Methode bietet ein einfaches, schnelles und reproduzierbares Screening-Protokoll für das Auftreten von hitzeinduzierten Anfällen in Epilepsie-Mausmodellen.
Epilepsie, die vierthäufigste Familie neurologischer Erkrankungen in den Vereinigten Staaten1, ist durch ein Ungleichgewicht des erregenden und hemmenden Antriebs im ZNS gekennzeichnet, das zu wiederkehrenden Anfällen führt. Fieberanfälle (FS) oder fieberbedingte Anfälle können in der Allgemeinbevölkerung auftreten, am häufigsten bei Kindern bereits im Alter von 3 Monaten bis 6-7 Jahren. Bei einigen Personen mit genetischen Mutationen, am häufigsten in einem Natriumkanalgen, kann FS jedoch über das Alter von 7 Jahren bis ins Erwachsenenalter hinaus bestehen bleiben. Dieser Zustand wird als Fieberkrämpfe plus oder FS + bezeichnet. Schnelle Fortschritte in der Genomsequenzierung haben über 1.300 Mutationen im menschlichen Natriumionenkanalgen SCN1A identifiziert, was es zu einem Hotspot für Epilepsiemutationen macht. SCN1A-Mutationen wurden mit einem breiten Spektrum von Anfallsleiden in Verbindung gebracht, darunter Fieberkrämpfe (FS), genetische Epilepsie mit Fieberkrämpfen plus (GEFS +) und Dravet-Syndrom (DS) 2,3,4,5,6. Etwa 20% der SCN1A-Missense-Mutationen führen zu GEFS+5,7,8. Die pädiatrische Anamnese komplexer oder längerer FS in der Kindheit kann sich anschließend zu schwächenderen Formen der Epilepsie wie Temporallappenepilepsie (TLE) 9,10,11 entwickeln. Das Dravet-Syndrom entsteht durch Kürzungsmutationen oder Funktionsverlust bei SCN1A und ist eine schwere Form der hartnäckigen Epilepsie, bei der im Kindesalter fieberhafte Anfälle auftreten, die sich zu refraktären Anfällen entwickeln und oft mit kognitiven, entwicklungsbedingten und motorischen Beeinträchtigungen verbunden sind2,5,12 . Da viele Personen mit GEFS+ und/oder DS fieberhafte Anfälle aufweisen, ist es unerlässlich, neuartige Therapien zu entwickeln, um diese Anfallsleiden besser zu bekämpfen.
Tiermodelle der SCN1A-assoziierten Epilepsie haben sich als von unschätzbarem Wert bei der Charakterisierung verschiedener Arten von Anfällen (fieberhaft vs. generalisiert) und der Sezierung des neuronalen Mechanismus der Anfallsgeneration13,14,15,16,17,18 erwiesen. Während die Untersuchung spontaner Anfälle über EEG / EMG-Aufzeichnungen in Nagetiergehirnen gut etabliert und ein sehr nützliches Werkzeug ist, haben nur wenige Studien versucht, Fieberkrämpfe in Mausmodellen nachzuahmen14,16,19,20,21,22,23 . Frühere Studien haben einen Strahl erhitzter trockener Luft oder einen Methacrylatzylinder, der mit einem thermischen System ausgestattet ist, oder Wärmelampen mit einem Temperaturregler in geschlossenen Testarenen verwendet9,16,21,22,23,24, um Anfälle durch Hyperthermie zu induzieren. Um die Körpertemperatur in einer kontrollierteren Umgebung zu erhöhen, verwendet das hier beschriebene Protokoll eine speziell angefertigte Kammer mit einem temperaturgesteuerten Heizsystem, das reproduzierbare Steigerungsraten der Körpertemperatur einer Maus in der Kammer ermöglicht. Die Wärmekammer wurde aus Holz (Länge 40 cm x Breite 34 cm x Höhe 31 cm) gebaut und mit einem digitalen Temperaturregler mit K-Thermoelement ausgestattet. Ein kleiner Axialventilator, der mit einer Heizung an der Rückseite der Kammer ausgestattet ist, leitet erwärmte Luft in die Kammer, die von einem digitalen Temperaturregler geregelt wird. Dieses Zwangsluftheizungssystem ermöglicht es, die Geschwindigkeit zu steuern, mit der die Kammertemperatur ansteigt. (Abbildung 1A,B). Das K-Thermoelement, das sich in der hölzernen Wärmekammer befindet, sendet eine Rückmeldung an den digitalen Temperaturregler, um während des Assays konstante Temperaturen in der Box aufrechtzuerhalten. Durch Einstellen der Temperatur am digitalen Temperaturregler kann der elektrische Ventilator erwärmte Zwangsluft durch Lüftungsschlitze leiten, um die Kammer gleichmäßig zu erwärmen (Abbildung 1A). Die Frontplatte der Wärmekammer besteht aus einer durchsichtigen Plexiglasplatte, die eine einfache Videoaufzeichnung der Versuche ermöglicht.
Erwachsene (P30-P40) Mäuse, heterozygot für eine Missense-Mutation in SCN1A, die GEFS + verursacht, und eine gleiche Anzahl von Wildtyp-Streukameraden, die als Kontrollgruppe dienen, wurden für jedes Experiment ausgewählt. Tiere, sowohl männliche als auch weibliche, die in diesen Studien verwendet wurden, wogen mindestens 15 g, da Wildtypmäuse mit einem geringeren Gewicht empfindlicher auf hitzebedingte Anfälle reagierten als schwerere Tiere im gleichen Alter. In der Pilotstudie wurde beobachtet, dass sowohl mutierte als auch Wildtyp-Mäuse die kühleren Ecken der Kammer auf der Rückseite suchten und dort für längere Zeit blieben. Um dies zu umgehen, wurde die effektive Bodengröße in der Wärmekammer-Testarena auf Länge 16,5 cm x Breite 21,5 cm x Höhe 27,5 cm reduziert, indem ein Holzblock B (Abmessungen 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) auf der rechten Seite der Kammer platziert wurde (Abbildung 1A). Die Wärmekammer wurde aus 1,9 cm starkem Sperrholz (Länge 40 cm x Breite 34 cm x Höhe 31 cm) gefertigt, mit weißem Laminat verkleidet und mit einem digitalen Temperaturregler mit K-Thermoelement ausgestattet. Die Laminatoberfläche der Kammerwände ist undurchlässig und kann zwischen den Versuchen durch Abwischen mit 70% Ethanol leicht desinfiziert werden. Die Temperatur der Wärmekammer wurde zunächst auf 50 °C eingestellt und vor Beginn des Experiments für mindestens 1 h vorgewärmt, um eine gleichmäßige Erwärmung innerhalb der Kammer zu gewährleisten. Jede Maus wurde mit einem Rektalthermometer zur kontinuierlichen Überwachung der Körpertemperatur während des gesamten Experiments ausgestattet. Eine einzelne Maus wurde jeweils in die Kammer gestellt und die Temperatur wurde zwischen der 1. und 10. Minute bei 50 ° C gehalten. Die Temperatur wurde dann für die 11.-20. Minute auf 55 ° C erhöht und schließlich für die 21. bis 30. Minute auf 60 ° C erhöht. Dies führte zu einer reproduzierbaren Steigerungsrate der Mauskörpertemperatur (Abbildung 2A). Jede Studie wurde auf Video aufgezeichnet und die Verhaltensanalyse wurde offline durchgeführt.
Das Heizprotokoll kann leicht modifiziert werden, um die Anfangstemperatur der Wärmekammer und die Rate, mit der die Kammer erwärmt wird, zu ändern, was wiederum ändert, wie schnell die Körpertemperatur der Maus während des Assays erhöht wird. Somit bietet diese Methode mehr Flexibilität gegenüber herkömmlichen Methoden bei der Einrichtung der Verhaltensbildschirme mit hitzeinduzierten Anfällen. Das hitzeinduzierte Anfallsprotokoll kann auch verwendet werden, um nach Antiepileptika zu suchen, die mutierte Mäuse widerstandsfähiger gegen hitzeinduzierte Anfälle machen oder die Schwellentemperatur erhöhen, bei der Anfälle beobachtet werden. In ähnlicher Weise können vorteilhafte Auswirkungen von restriktiven Diätregimen wie der Keto-Diät auf hitzeinduzierte Anfälle bei normalen Chow-gefütterten vs. Keto-gefütterten Mäusen untersucht werden.
Abbildung 1: Beschreibung der speziell angefertigten Mauswärmekammer. (A) Die Vorderseite der hölzernen Mauswärmekammer zeigt das seitliche Bedienfeld mit dem Ein-/Ausschalter, der den digitalen Temperaturregler, das K-Thermoelement, den EIN/AUS-Schalter des Heizlüfters und die Wärmeanzeige einschaltet. Die Außenmaße der Box und der inneren Testarena sind in cm dargestellt. Ein Holzblock B, mit dem die Oberfläche der Testarena effektiv reduziert wird, ist ebenfalls zu sehen. Der Boden der Testarena ist mit Lehmbettwäsche bedeckt, um zu verhindern, dass Mäuse direkt mit beheizten Holzoberflächen in Berührung kommen. (B) Die Rückseite der Wärmekammer zeigt den Ventilator, der an der oberen Lüftungsöffnung montiert ist, und das Netzkabel zur Stromversorgung der Kammer. Diese Abbildung ist gegenüber Abbildung 3 in Das et al., 2021, eNeuro14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Wir beschreiben ein einfaches und effektives Protokoll zum Screening auf das Auftreten von hitzeinduzierten Anfällen bei Mäusen, dem Verhaltensäquivalent von Fieberkrämpfen bei menschlichen Patienten. Der Assay bewertet mehrere Parameter – einschließlich des Prozentsatzes der Mäuse, die Anfälle zeigen, der Anfallsschwelle, der Schwere der Anfälle auf einer Racine-Skala, um die Empfindlichkeit von Kontroll- und Testmäusegruppen gegenüber dem Anstieg der Körpertemperatur zu vergleichen.
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll besteht darin, die Wärme in der Kammer zu erhöhen und gleichzeitig die Körpertemperatur der Maus kontinuierlich zu überwachen. Es ist unerlässlich, dass die maximale Körpertemperatur, die die Mäuse in diesen Assays erfahren, 44 ° C beträgt, da Wildtiere bei Körpertemperaturen > 44 ° C hitzebedingte Anfälle erleiden können. Eine Vorbehandlung mit Vollnarkose oder Analgetika kann die Körperkerntemperatur von Tieren senken oder die Thermoregulation beeinträchtigen, was wiederum die Datenerfassung der Anfallsschwelle beeinträchtigen würde. Daher konnten Mäuse unter diesem Screening-Protokoll während des 30-minütigen Testfensters nicht mit diesen Wirkstoffen versorgt werden. Alle Verfahren müssen vom IACUC-Ausschuss der Institution genehmigt werden. Um eine kontinuierliche Überwachung der Körperkerntemperatur der Maus während des Assays zu gewährleisten, kleben Sie den rektalen Temperaturfühler sicher an den Schwanz der Mäuse. Wenn während des Assays festgestellt wird, dass die Körpertemperatur der Maus auch nach Erhöhung der Temperatur der Mauskammer für längere Zeit unverändert bleibt, stellen Sie sicher, dass der rektale Temperaturfühler nicht aus der Maus herausgekommen ist oder lose am Schwanz befestigt ist.
Der genetische Hintergrund von Mausmodellen kann die Empfindlichkeit gegenüber der SCN1A-Mutation und pharmakologisch induzierten Anfällen beeinflussen18,25,26,27. Wie in den obigen Ergebnissen diskutiert, kann der genetische Hintergrund der Mäuse ihre Anfälligkeit für hitzeinduzierte Anfälle beeinflussen. Scn1a K1270T GEFS + mutierte Mäuse wurden in zwei genetischen Hintergründen getestet – 129X1 und B6NJ, und ein kleiner Prozentsatz von Wildtyp-Mäusen (33%) im anfallsempfindlichen B6NJ-Hintergrund, wurden ebenfalls beobachtet, um hitzeinduzierten Anfällen zu unterziehen. Im Vergleich zu den heterozygoten mutierten Scn1aKT/+-Mäusen erlebten die B6NJ-Wildtyp-Mäuse jedoch hitzeinduzierte Anfälle bei einer signifikant höheren Temperaturschwelle. Dies bestätigt, dass die genetische Mutation (Scn1a K1270T), die durch CRISPR-Knock-in eingeführt wurde, die mutierten Mäuse anfälliger für Hyperthermie-induzierte Anfälle macht.
Die Annahme dieses Protokolls hat mehrere Vorteile, die im Folgenden zusammengefasst werden. Erstens, im Gegensatz zur Verwendung von Trockenluftströmen oder beheizten Lampen, bietet eine temperaturgesteuerte Zwangsluft, die in einem geschlossenen Raum eingerichtet ist, dem Experimentator mehr Kontrolle über das Aufheizen der Testarena mit der gewünschten Geschwindigkeit. Die Schritte im Heizprotokoll können leicht geändert werden, um die Starttemperatur, die Dauer jedes Schritts usw. zu erhöhen / zu verringern, um ältere Mäuse zu screenen, die schwerer oder größere Nagetiere wie Ratten sind. Zweitens liefert die kontinuierliche Überwachung der Körpertemperatur der Maus über die angeschlossene rektale Sonde wertvolle Informationen über die Rate der Körpertemperaturänderung in der einzelnen Maus während des gesamten Assays. Dies ermöglicht es dem Experimentator, genau zu beobachten, dass die Temperaturänderungsrate in der Maus 0,25-0,5 ° C / min nicht überschreitet (was für die Tiere stressig sein könnte), wenn er dieses Protokoll an andere Testarenen anpasst. Wichtig ist, dass die Rate der Änderung der Körpertemperatur im Laufe der Zeit in verschiedenen Mäusegruppen Aufschluss über ihre Fähigkeit zur Thermoregulation geben kann und hilfreich sein könnte, um zu verstehen, ob Fieberkrämpfe, die Mutationen verursachen, auch die Thermoregulation bei Mäusen verändern. Drittens stellt die kontinuierliche Überwachung der Körpertemperatur sicher, dass die mit diesem Protokoll durchgeführten Temperaturmessungen der Anfallsschwelle genau sind, da sie gleichzeitig mit dem ersten Anfall der Maus aufgezeichnet werden. Wenn die Körpertemperatur des Tieres nicht kontinuierlich überwacht wird oder die Anfallsschwellentemperatur gemessen wird, nachdem das Tier aus der Testarena genommen wurde, können die Anfallsschwellenwerte aufgrund der Zeit, die benötigt wird, um die Mäuse nach Anfällen zu behandeln, variieren. Schließlich umgeht diese Methode die Notwendigkeit, invasive Methoden zu verwenden, um Fieber (durch Injektion von Krankheitserregern) bei Mäusen zu induzieren, um Fieberkrämpfe bei menschlichen Patienten nachzuahmen.
Eine der Einschränkungen dieses Protokolls besteht darin, dass es schwierig ist, jugendliche (weniger als P30 im Alter) Mäuse auf hitzeinduzierte Anfälle zu untersuchen. Das Protokoll wurde entwickelt, um die Empfindlichkeit erwachsener Mäuse (P30-P40 und höher) gegenüber hitze- oder hyperthermieinduzierten Anfällen zu untersuchen. Nach unserer Erfahrung sind die jüngeren Wildtyp-Mäuse, insbesondere diejenigen, die unter 15 g wiegen, eher hitzeinduzierten Anfällen ausgesetzt, die auf unterentwickelte Thermoregulationsmechanismen, physiologischen thermischen Stress oder eine Kombination aus beidem zurückzuführen sein könnten. Daher ist es nicht ideal, den hitzeinduzierten Anfallsbildschirm an jugendlichen Mäusen mit diesem Protokoll durchzuführen.
Zukünftige Studien, die die EEG-Überwachung kombinieren, während die Maus hitzeinduzierten Anfällen ausgesetzt wird, können Aufschluss über EEG-Anfallsmuster von hitzeinduzierten Anfällen geben, ähnlich wie in einer früheren Studie19. Die neuronale Aktivität in bestimmten Bereichen des Mausgehirns kann durch die Kombination von optogenetischen Ansätzen und immunhistochemischen Studien nach der Gewinnung des Hirngewebes verfolgt werden. Auch die Auswirkungen von restriktiven Diäten wie der Keto-Diät auf die Verringerung von Fieberkrämpfen können bewertet werden, indem keto-gefütterte Mäuse und normale Chow-gefütterte Mäuse einem hitzeinduzierten Anfallsprotokoll unterzogen werden. In ähnlicher Weise können Epilepsie-Screening-Paradigmen entwickelt werden, um antiepileptische Wirkstoffkandidaten zu testen und zu identifizieren, die hitzeinduzierte Anfälle bei medikamentengefütterten oder behandelten Mäusen im Vergleich zu mit Fahrzeugen gefütterten oder Kontrollmäusen verbessern oder unterdrücken.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Connor J. Smith für seine Hilfe beim Bau der maßgeschneiderten Mauswärmekammer. Wir danken den O’Dowd-Labormitgliedern, Lisha Zeng und Andrew Salgado, für die Standardisierung des Erwärmungsprotokolls in den frühen Phasen der Assay-Entwicklung. Wir danken auch Danny Benavides und Kumar Perinbam für die Videoaufzeichnung von Teilen des experimentellen Verfahrens für das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss (NS083009) unterstützt, der an D.O.D. vergeben wurde.
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