小鼠硬脑膜刺激和眶周冯弗雷测试作为头痛的临床前模型
Summary
偏头痛最显着的症状是严重的头部疼痛，据推测这是由支配脑膜的感觉神经元介导的。在这里，我们提出了一种以微创方式局部将物质应用于硬脑膜的方法，同时使用面部超敏反应作为输出。
Abstract
颅脑膜由硬脑膜、蛛网膜和软脑膜组成，被认为主要服务于神经系统的结构功能。 例如，它们保护大脑免受颅骨的侵害，并锚定/组织皮层的血管和神经元供应。然而，脑膜也与偏头痛等神经系统疾病有关，偏头痛期间经历的疼痛归因于局部无菌炎症和随后局部伤害感受传入物的激活。在脑膜的各层中，硬脑膜在偏头痛的病理生理学中特别重要。它是高度血管化的，含有局部伤害感受神经元，并且是各种常驻细胞（如免疫细胞）的家园。局部脑膜微环境的细微变化可能导致硬膜血管周围伤害感受器的激活和致敏，从而导致偏头痛。研究试图通过使用体内电生理学，成像技术或行为模型来解决硬脑膜传入物如何被激活/致敏，但这些通常需要非常侵入性的手术。该协议提出了一种在小鼠硬脑膜上相对非侵入性地应用化合物的方法，以及一种在硬膜刺激后使用眶周von Frey测试测量头痛样触觉敏感性的合适方法。该方法保持硬脑膜和颅骨的完整性，并通过未融合的矢状和兰类缝合线交界处的0.65mm改性套管注射物质，从而减少侵入性技术的混杂效应。这种临床前模型将使研究人员能够研究广泛的硬膜刺激及其在偏头痛病理进展中的作用，例如伤害感受器激活，免疫细胞激活，血管变化和疼痛行为，同时保持颅骨和脑膜的无损伤条件。
Introduction
偏头痛仍然是世界范围内的一个主要公共卫生问题。世界卫生组织将其列为世界上第六大流行疾病，折磨着地球人口的不到15%1 ，并对社会造成巨大的社会经济负担2，3。治疗方案及其疗效并不理想，只能缓解症状，不会显著改变偏头痛发生率以下的病理生理学事件4，5。缺乏治疗成功可能是由于偏头痛是一种多因素疾病，其病理学知之甚少，导致治疗靶点数量有限。在动物模型中完全捕获偏头痛也具有挑战性，特别是考虑到偏头痛诊断是基于与患者进行口头交流，这些患者描述了他们对偏头痛特征（如先兆，头痛，畏光和异常疼痛）的经历。尽管如此，重要的是要注意，偏头痛治疗的最新进展目前优于许多神经系统疾病的治疗，这些疾病已被临床前模型充分验证。例如，靶向降钙素基因相关肽或其受体的单克隆抗体和小分子在改善偏头痛患者的生活质量方面非常成功，并可能改变偏头痛的临床管理。虽然在理解这种疾病方面取得了进展，但仍有许多问题有待阐明。
根据临床前动物模型和人类研究，人们普遍认为偏头痛是由脑膜内伤害性纤维的异常激活引起的，这些纤维通过三叉神经和上颈背根神经节6，7，8，9，10发出信号。尽管有这一理论，许多研究仍然使用全身给药来了解偏头痛的潜在促成机制。虽然药物的全身给药大大加强了我们的理解，但这些发现并没有直接评估目标组织内的局部作用是否在偏头痛中起作用。相反，有几项研究采取了刺激硬脑膜的方法;然而，这些实验需要通过侵入性开颅术植入套管，并将恢复时间延长11，12。由于这些局限性，我们开发了一种微创方法来局部刺激硬脑膜，其中缺乏开颅手术消除了手术后的恢复，并允许在清醒的动物中立即进行测试12，13，14。这些注射在轻度异氟醚麻醉下进行，并在小鼠矢状和兰类缝合线的交界处施用。
已经开发了几种方法来评估啮齿动物的伤害感受行为反应15。据报道，大约80%的偏头痛患者的皮肤异常痛16，17 ，代表了用于啮齿动物的潜在转化终点。在临床前模型中，冯弗雷细丝在啮齿动物爪子足底区域的应用已被用于评估临床前偏头痛模型中的疼痛行为。这种方法的主要局限性是它不测试头区域。面部鬼脸评分已用于通过分析诱导疼痛刺激后的面部表情来捕获啮齿动物的疼痛行为18，19。然而，其局限性包括仅捕获对急性刺激的反应，而不是慢性口面部疼痛状况。面部修饰和减少饲养也被认为是偏头痛临床前模型中行为反应的输出20，21。前者的局限性包括难以将疼痛反应与正常的常规修饰和其他感觉（如瘙痒）区分开来。在后者的情况下，在将啮齿动物引入新环境后，饲养行为通常会迅速下降。虽然这些行为终点中的每一个在理解导致疼痛状况的各种机制方面都很有价值，但迫切需要偏头痛等疼痛疾病的临床前模型包括专门捕获头部超敏反应的终点。评估硬膜刺激后眶周皮肤的触觉超敏反应是一种可以更好地了解导致偏头痛的机制的方法，其中感觉症状主要是头部性。在这里，我们描述了一种将物质施用到小鼠硬脑膜上的方法，作为偏头痛的临床前模型。在硬膜应用之后，我们还提出了一种详细的方法，用于测试眶周触觉超敏反应，使用Dixon上下法中应用的校准von Frey细丝。
Protocol
Representative Results
Discussion
尽管缺乏组织损伤，但硬脑膜中局部伤害感受系统的适应不良变化被认为是偏头痛发作头痛阶段的关键因素25，26。在这里，该研究提出了一种方法，其中对硬脑膜的微创刺激可以诱导面部触觉过敏。阐明硬膜伤害感受器激活所涉及的机制和事件而不对颅骨和组织造成损害，可以更准确地反映临床前模型中的偏头痛机制。
开颅术和?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了美国国立卫生研究院的支持（NS104200和NS072204至GD）。
Materials
| 4 oz Hot Paper Cups | Choice Paper Company | 5004W | https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html |
| Absorbent Underpads | Fisherbrand | 14-206-65 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048 |
| C313I/SPC Internal 28 G cannula | P1 Technologies (formerly Plastics One) | 8IC313ISPCXC | I.D. 18 mm, O.D. 35 mm |
| Gastight Model 1701 SN Syringes | Hamilton | 80008 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008 |
| Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm | Cole-Palmer | EW-96460-10 | https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010 |
| Stand with chicken wire | Custom | The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge | |
| Testing Rack with individual Chambers | Custom | Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup. | |
| von Frey Filaments | Touch test/Stoelting | 58011 | https://www.stoeltingco.com/touch-test.html |
References
- GBD 2016 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Woldeamanuel, Y. W., Cowan, R. P. Migraine affects 1 in 10 people worldwide featuring recent rise: A systematic review and meta-analysis of community-based studies involving 6 million participants. Journal of the Neurological Sciences. 372, 307-315 (2017).
- Burch, R. C., Loder, S., Loder, E., Smitherman, T. A. The prevalence and burden of migraine and severe headache in the United States: updated statistics from government health surveillance studies. Headache. 55 (1), 21-34 (2015).
- Ashina, M. Migraine. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1866-1876 (2020).
- Ashina, M., et al. Migraine: integrated approaches to clinical management and emerging treatments. Lancet. 397 (10283), 1505-1518 (2021).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: Moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
- Koyuncu Irmak, D., Kilinc, E., Tore, F. Shared Fate of Meningeal Mast Cells and Sensory Neurons in Migraine. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 136 (2019).
- Levy, D. Migraine pain, meningeal inflammation, and mast cells. Current Pain and Headache Reports. 13 (3), 237-240 (2009).
- Levy, D., Labastida-Ramirez, A., MaassenVanDenBrink, A. Current understanding of meningeal and cerebral vascular function underlying migraine headache. Cephalalgia. 39 (13), 1606-1622 (2019).
- Phebus, L. A., Johnson, K. W. Dural inflammation model of migraine pain. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Fried, N. T., Maxwell, C. R., Elliott, M. B., Oshinsky, M. L. Region-specific disruption of the blood-brain barrier following repeated inflammatory dural stimulation in a rat model of chronic trigeminal allodynia. Cephalalgia. 38 (4), 674-689 (2018).
- Avona, A., et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models. The Journal of Neuroscience. 39 (22), 4323-4331 (2019).
- Burgos-Vega, C. C., et al. Non-invasive dural stimulation in mice: A novel preclinical model of migraine. Cephalalgia. 39 (1), 123-134 (2019).
- Avona, A., et al. Meningeal CGRP-Prolactin interaction evokes female-specific migraine behavior. Annals of Neurology. 89 (6), 1129-1144 (2021).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Lipton, R. B., et al. Cutaneous allodynia in the migraine population. Annals of Neurology. 63 (2), 148-158 (2008).
- Goadsby, P. J. Migraine, allodynia, sensitisation and all of that. European Neurology. 53, 10-16 (2005).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
- Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 11 (2019).
- Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central CGRP mechanisms. The journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
- Dixon, W. J., Mood, A. M. A method for obtaining and analyzing sensitivity data. The Journal of the American Statistical Association. 43 (241), 109-126 (1948).
- Dixon, W. The up-and-down method for small samples. The Journal of the American Statistical Association. 60, (1965).
- Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Molecular Pain. 10, 26 (2014).
- Ramachandran, R. Neurogenic inflammation and its role in migraine. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 301-314 (2018).
- Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K. Does inflammation have a role in migraine. Nature Reviews Neurology. 15 (8), 483-490 (2019).
- Stokely, M. E., Orr, E. L. Acute effects of calvarial damage on dural mast cells, pial vascular permeability, and cerebral cortical histamine levels in rats and mice. Journal of Neurotrauma. 25 (1), 52-61 (2008).
- Theoharides, T. C., Donelan, J., Kandere-Grzybowska, K., Konstantinidou, A. The role of mast cells in migraine pathophysiology. Brain Research Reviews. 49 (1), 65-76 (2005).
- Conti, P., et al. Progression in migraine: Role of mast cells and pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. European Journal of Pharmacology. 844, 87-94 (2019).
- Rea, B. J., et al. Peripherally administered calcitonin gene-related peptide induces spontaneous pain in mice: implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).
