Stimolazione durale e test di von Frey periorbitale nei topi come modello preclinico di cefalea

Summary

Il sintomo più notevole dell’emicrania è il forte dolore alla testa, e si ipotizza che questo sia mediato dai neuroni sensoriali che innervano le meningi. Qui, presentiamo un metodo per applicare localmente sostanze alla dura in modo minimamente invasivo mentre si utilizza l’ipersensibilità facciale come output.

Abstract

Si ritiene che le meningi craniche, composte da dura madre, aracnoide e pia madre, servano principalmente funzioni strutturali per il sistema nervoso. Ad esempio, proteggono il cervello dal cranio e ancorano / organizzano l’apporto vascolare e neuronale della corteccia. Tuttavia, le meningi sono anche implicate in disturbi del sistema nervoso come l’emicrania, dove il dolore sperimentato durante un’emicrania è attribuito all’infiammazione sterile locale e alla successiva attivazione di afferenze nocicettive locali. Tra gli strati nelle meningi, la dura madre è di particolare interesse nella fisiopatologia dell’emicrania. È altamente vascolarizzato, ospita neuroni nocicettivi locali ed è sede di una vasta gamma di cellule residenti come le cellule immunitarie. Sottili cambiamenti nel microambiente meningeo locale possono portare all’attivazione e alla sensibilizzazione dei nocicettori perivascolari durali, portando così al dolore emicranico. Gli studi hanno cercato di affrontare il modo in cui le afferenze durali vengono attivate / sensibilizzate utilizzando elettrofisiologia in vivo, tecniche di imaging o modelli comportamentali, ma questi comunemente richiedono interventi chirurgici molto invasivi. Questo protocollo presenta un metodo per l’applicazione relativamente non invasiva di composti sulla dura madre nei topi e un metodo adatto per misurare la sensibilità tattile simile alla cefalea utilizzando il test periorbitale di von Frey dopo stimolazione durale. Questo metodo mantiene l’integrità della dura e del cranio e riduce gli effetti confondenti delle tecniche invasive iniettando sostanze attraverso una cannula modificata di 0,65 mm alla giunzione di suture sagittali e lambdoidi non fuse. Questo modello preclinico consentirà ai ricercatori di studiare una vasta gamma di stimoli durali e il loro ruolo nella progressione patologica dell’emicrania, come l’attivazione dei nocicettori, l’attivazione delle cellule immunitarie, i cambiamenti vascolari e i comportamenti del dolore, il tutto mantenendo condizioni prive di lesioni al cranio e alle meningi.

Introduction

Il dolore emicranico rimane un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo. L’Organizzazione Mondiale della Sanità la classifica come la sesta malattia più diffusa al mondo, che affligge poco meno del 15% della popolazione della Terra¹ e causa un notevole onere socioeconomico sulla società ^2,3. Le opzioni di trattamento e la loro efficacia sono state non ottimali e forniscono solo sollievo sintomatico e non modificano significativamente gli eventi fisiopatologici che sono alla base dell’insorgenza di emicrania ^4,5. La mancanza di successo del trattamento è probabilmente dovuta al fatto che l’emicrania è un disturbo multifattoriale la cui patologia è poco conosciuta, portando a un numero limitato di bersagli terapeutici. L’emicrania è anche difficile da catturare completamente nei modelli animali, soprattutto dato che la diagnosi di emicrania è fatta sulla base della comunicazione verbale con i pazienti che descrivono la loro esperienza con segni distintivi di emicrania come aura, mal di testa, fotofobia e allodinia. Ciononostante, è importante notare che i recenti progressi nei trattamenti per l’emicrania stanno attualmente superando i trattamenti per molte condizioni neurologiche che sono state ben convalidate dai modelli preclinici. Ad esempio, gli anticorpi monoclonali e le piccole molecole che colpiscono il peptide correlato al gene della calcitonina o il suo recettore hanno avuto molto successo nel migliorare la qualità della vita di chi soffre di emicrania e possono potenzialmente trasformare la gestione clinica dell’emicrania. Mentre c’è stato un progresso nella comprensione di questo disturbo, continua ad esserci molto ancora da chiarire.

Sulla base di modelli animali preclinici e studi sull’uomo, è ampiamente accettato che l’emicrania è iniziata dall’attivazione aberrante delle fibre nocicettive all’interno delle meningi che segnalano attraverso i gangli della radice dorsale del trigemino e della cervicale superiore ^6,7,8,9,10. Nonostante questa teoria, molti studi usano ancora la somministrazione sistemica di farmaci per comprendere i meccanismi sottostanti che contribuiscono all’emicrania. Mentre il dosaggio sistemico dei farmaci ha sostanzialmente rafforzato la nostra comprensione, questi risultati non valutano direttamente se le azioni locali all’interno del tessuto bersaglio di interesse svolgono un ruolo nell’emicrania. Al contrario, diversi studi hanno adottato un approccio per stimolare la dura; tuttavia, questi esperimenti richiedono l’impianto di cannula tramite una craniotomia invasiva e tempi di recupero prolungati^11,12. A causa di queste limitazioni, abbiamo sviluppato un approccio minimamente invasivo per stimolare localmente la dura in cui la mancanza di una craniotomia elimina il recupero post-chirurgico e consente test immediati in animali svegli 12,13,14. Queste iniezioni vengono eseguite in anestesia con isoflurano leggero e somministrate alla giunzione delle suture sagittale e lambdoide nei topi.

Sono stati sviluppati diversi approcci per valutare le risposte comportamentali nocicettive nei roditori¹⁵. L’allodinia cutanea è stata riportata in circa l’80% dei malati di emicrania^16,17 e rappresenta un potenziale endpoint traslazionale per l’uso nei roditori. Nei modelli preclinici, l’applicazione di filamenti di von Frey alla regione plantare della zampa del roditore è stata utilizzata per valutare i comportamenti del dolore nei modelli preclinici di emicrania. Il limite principale di questo approccio è che non testa la regione cefalica. Il punteggio della smorfia facciale è stato utilizzato per catturare i comportamenti del dolore nei roditori analizzando le espressioni facciali dopo l’induzione di stimoli dolorosi^18,19. Tuttavia, i suoi limiti includono solo la cattura di risposte a stimoli acuti e non condizioni di dolore orofacciale cronico. La toelettatura facciale e la diminuzione dell’allevamento sono anche considerate output di risposte comportamentali in modelli preclinici di emicrania^20,21. I limiti del primo includono difficoltà nel differenziare le risposte al dolore dalla normale toelettatura di routine e altre sensazioni come il prurito. Nel caso di quest’ultimo, i comportamenti di allevamento in genere diminuiscono rapidamente dopo l’introduzione dei roditori in nuovi ambienti. Sebbene ciascuno di questi endpoint comportamentali sia prezioso nella comprensione di vari meccanismi che contribuiscono alle condizioni del dolore, vi è un bisogno critico di modelli preclinici di disturbi del dolore come l’emicrania per includere endpoint che catturano specificamente le risposte di ipersensibilità cefalica. Valutare l’ipersensibilità tattile della pelle periorbitale dopo stimolazione durale è un metodo che può fornire una migliore comprensione dei meccanismi che contribuiscono all’emicrania in cui i sintomi sensoriali sono prevalentemente di natura cefalica. Qui, descriviamo un metodo per somministrare sostanze sulla dura del topo come modello preclinico di emicrania. Dopo l’applicazione durale, presentiamo anche un metodo dettagliato per testare l’ipersensibilità tattile periorbitale utilizzando filamenti di von Frey calibrati applicati nel metodo Up-down di Dixon.

Protocol

Tutte le procedure sono state condotte previa approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali presso l’Università del Texas a Dallas. In questo studio sono stati utilizzati topi ICR (CD-1) (30-35 g) e C57/BL6 (25-30 g) di età compresa tra 6-8 settimane. 1. Infusore durale Creare gli infusori/iniettori del mouse modificando una cannula interna e un infusore disponibili in commercio per iniezioni unilaterali con un cappuccio in plastica silice fusa non metal…

Representative Results

Questo metodo di iniezione viene utilizzato per somministrare stimoli sulla dura dei topi in modo che possano verificarsi successivi test comportamentali. L’output comportamentale più comune misurato con questo modello è l’ipersensibilità facciale cutanea valutata tramite von Frey 12,13,14. Qui mostriamo come questo modello può essere utilizzato per valutare i potenziali contributi specifici del sesso alla patologia dell’emi…

Discussion

I cambiamenti disadattivi nel sistema nocicettivo locale nella dura sono considerati un contributo chiave alla fase di mal di testa degli attacchi di emicrania nonostante la mancanza di lesioni tissutali^25,26. Qui lo studio presenta un metodo in base al quale la stimolazione minimamente invasiva della dura può indurre ipersensibilità tattile facciale. Chiarire i meccanismi e gli eventi coinvolti nell’attivazione del nocicettore durale senza causare danni al cra…

Materials

4 oz Hot Paper Cups	Choice Paper Company	5004W	https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads	Fisherbrand	14-206-65	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula	P1 Technologies (formerly Plastics One)	8IC313ISPCXC	I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes	Hamilton	80008	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm	Cole-Palmer	EW-96460-10	https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire	Custom		The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers	Custom		Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments	Touch test/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html