本方案描述了通过电刺激麻醉猪的腓骨共同神经获得的体内扭矩数据的评估和解释的简明实验细节。
骨骼肌力量的可靠评估可以说是神经肌肉和肌肉骨骼疾病和损伤研究中最重要的结局指标,特别是在评估再生疗法的疗效时。此外,翻译许多再生疗法的一个关键方面是在大型动物模型中展示可扩展性和有效性。已经建立了各种生理制剂来评估基础科学研究中的内在肌肉功能特性,主要是在小动物模型中。这些实践可以分为: 体外 (孤立的纤维,纤维束或整个肌肉), 原位 (具有完整的血管形成和神经支配但远端肌腱附着在力传感器上的肌肉)和 体内 (肌肉或肌肉单元的结构保持完整)。这些准备工作各有长处,也有短处。然而, 体内 强度测试的一个明显优点是能够在同一动物中进行重复测量。本文介绍了可靠地评估体内后肢背屈肌响应于麻醉猪 中 标准腓神经电刺激而产生的等距扭矩的材料和方法。
骨骼肌的主要功能是产生力量,这最终使呼吸,进食和行走等活动成为可能。降低骨骼肌功能能力的疾病可导致表现下降(职业或运动),残疾或死亡。例如,老年人群肌肉质量和功能的维持与生活质量以及进行日常生活的基本和工具性活动的能力呈正相关1,2。而且,杜氏肌营养不良症患者的肌肉力量下降导致无法行走和呼吸衰竭,最终导致过早死亡3,4,5。因此,肌肉力量测量是涉及神经肌肉疾病或损伤的研究的关键结局测量。
在临床研究中,最大自愿等距或等速扭矩(和/或疲劳指数)通常用作功能能力的指标6.在动物研究中,可以在麻醉下使用电神经刺激在体内进行类似的测量。值得注意的是,体内制剂是微创的,肌肉组织,肌腱,脉管系统和神经支配保持完整,因此允许重复的功能评估7,8,9,10,11。该制剂通常用于小型啮齿动物模型,并在较小程度上用于较大的动物模型,例如兔子12,狗13,14,绵羊15和猪16,17。这种方法的一般使用可能对许多转化研究产生影响,例如在脊髓性肌萎缩(SMA)的基因工程猪(猪)模型中18。本文介绍了评估神经刺激诱导的猪背屈肌群在体内的最大等距扭矩的方法。所提出的技术最初是从最初开发的用于评估小鼠前部肌肉扭矩19,20的技术中改编而来的,随后通过研究损伤后扭矩产生能力的经验进行了改进17,21,22,23,24,25,26,27,28在开发过程中16在各种猪模型中。
该协议强调使用需要与称重传感器和电刺激器集成的计算机的方法进行 体内 等距扭矩测量。这里介绍的方法使用市售的集成猪等距脚踏板测试设备,平台设备和相应的软件(参见 材料表)。但是,该方法可以适应使用其他市售或定制的软件,数据采集设备和刺激器。这些方法旨在用于专用的大型动物手术室,该套件中充满了标准设备,例如:锁定手术台,用于测试平台,呼吸机和监测设备的第二个等高锁定台,以及加热垫或其他设备以保持体温。
需要以下团队成员进行这些方法:一名熟练的麻醉技师和两名研究人员进行功能测试。这些人将共同努力,在平台设备上进行肢体的初始稳定。然后,两名人员中的一名将负责电极放置/定位,另一名负责测试期间的计算机应用。
关键步骤、修改和故障排除
为了最大限度地减少数据可变性并最大限度地提高方法的成功率,突出显示了以下关键步骤。
最佳神经刺激
这种实验方法从神经轴突去极化开始,依赖于正确的电极放置和优化的电刺激。对与骨特征点相关的神经解剖结构进行尸检分析有助于在测试期间可视化适当的电极放置。获得最大抽搐转矩有助于确定输送到神经轴突的适当电流(以毫安为单位;mA)。在测试开始时优化神经刺激时,要记住两个值:(1)抽搐与泰坦尼克的比率约为1:5,例如,〜2 N·m抽搐扭矩对应于10 N·m的泰坦尼克扭矩(图3);(2)对身体质量的典型扭矩为每公斤体重〜0.3 N·m(图4)。如果峰值抽搐扭矩看起来很低,请取下电极并尝试再次放置。请务必检查刺激器设置、BNC 连接和电极连接。如上所述,如果在关节角之间定位肢体期间移动过多,则可能需要在收缩之间重新放置电极(图2)。请注意,实验性和介入性方法可能会影响这些值。
正确的生物力学对齐
起始肌肉长度会影响肌肉收缩力(长度-张力关系),肌肉长度可以根据髋关节、膝关节和踝关节对齐而变化。四肢之间和猪之间的关节角度必须标准化。强烈建议髋关节和膝关节角度为 90°。稍微足底屈曲的踝关节位置(距中性 0° 踝关节角度约 30°)是峰值强度的最佳选择。它反映了猪和狗站立时踝关节的自然解剖位置。所有接头还应与脚踏板和扭矩传感器平行,以避免由于垂直扭矩矢量的贡献而损失可测量的扭矩。强烈建议在将脚固定在脚踏板上并用肢体夹紧杆固定膝关节后,检查髋关节-膝关节角度和脚踏板-关节对齐情况(图1)。如果存在不对中,请解锁并取下杆,并将猪重新定位在手术台上。虽然标准化研究中的关节角对于最小化数据差异至关重要,但生物力学对齐存在显着的局限性,如下所述。
关于现有或替代方法的重要性
可用于猪模型的临床相关和非侵入性肌肉功能评估的替代示例包括跑步机步行距离,肌电图和主动肌肉横波电图。作为人类6分钟步行测试,跑步机步行测试可以评估大型动物的疾病进展和干预成功率33,34,35。通常,在适应期后,动物在不同的跑步机速度和/或倾斜水平下行走直到顺应性结束。食物奖励通常对于实现最大的动机是必要的。然而,跑步机行走结果仅提供肌肉收缩功能的间接解释,这是由于受试者动机,非最大运动单位募集以及对其他身体系统(如心血管,骨骼和呼吸系统)的固有共同依赖等局限性。
另一方面,肌电图提供了对骨骼肌系统的稍微更好的直接评估,因为肌电图电极直接放置在感兴趣的肌肉群36,37,38上。然后EMG电极测量集体肌肉活动(去极化肌肉纤维)。这种肌肉活动基于运动单位募集和速率编码(发送到招募的运动单位的行动电位的频率)。然而,使用表面肌电图无法分离运动单位募集与速率编码的相对贡献。此外,肌电图依赖于受试者产生最大收缩的意愿,这种程度的合作在大型动物模型中不太可能。虽然评估步态周期内肌电图的变化可能会有所帮助,但这些数据并不代表目标骨骼肌群的最大功能能力。利用 B 模式和横波弹性成像的超声成像是另一种用于评估肌肉功能的非侵入性方法。通过弹性成像测量的杨氏模量与增加的肌肉负荷39,40之间存在良好的相关性。横波弹性成像已被验证并用作被动组织僵硬度41,42,43,44,45的定量测量,包括在猪体积肌损失损伤模型23中。它也可以用作间接测量主动肌肉力量产生39。然而,与肌电图相似的受试者意愿和合作进行宫缩的限制仍然存在。
与跑步机步行距离和肌电图相比,此处描述的 体内 方案提供了可靠,可重复和最大的肌肉功能评估。该协议以受控的,可量化的方式唤起肌肉收缩,与动机无关。具体而言,经皮电极用于刺激绕过中枢神经系统的神经轴突。神经轴突的去极化使所有运动单元都参与进来,消除了与运动单元募集相关的变异性。此外,研究者控制速率编码(刺激频率)。由此产生的适用于这种方法的神经肌肉生理学始于Ranvier节点处的电压门控钠通道激活。所有后续(或下游)生理学都参与其中,包括激发- 收缩耦合和跨桥循环。 体内 非侵入性肌肉分析的一个显着优点是可以重复测量收缩肌功能,例如每周,以监测损伤,干预或疾病进展后的肌肉力量。
方法的局限性
该协议中描述的 体内 设备允许被动和主动等距扭矩作为关节角和刺激频率的函数。所使用的测试装置不支持动态收缩的测量(例如,等速偏心或同心收缩)。该装置允许105°运动范围来表征扭矩 – 关节角度关系,并使用最大扭矩范围为〜50 N·m的称重传感器。特定的实验问题可能需要这些规格之外的性能特征。值得注意的是,如果需要,该所描述的设备上的称重传感器可以交换为更大的扭矩范围。
本文中描述的测量体内最大神经肌肉强度 的 方案具有显著的局限性。首先,这种方法需要麻醉,根据动物设施协议和资源,麻醉可能以不同的方式进行。已知麻醉剂对神经肌肉功能具有不同的影响,并且已被证明以麻醉剂型和剂量依赖性方式改变小鼠 体内 背屈肌扭矩的产生29。麻醉剂对大型动物 体内 扭矩的差异效应尚不清楚;因此,对照组和实验组必须具有相同的麻醉剂(例如,所有组施用氯胺酮)来控制这种变异性。其次,对 体内 扩散模式的依赖限制了对收缩功能障碍和急性药物毒性的细胞机制的探索。例如,咖啡因可以在分离肌肉的 体外 器官浴测试期间使用,以刺激肌质网钙释放,直接绕过激发 – 收缩偶联46 。诱导这种效应(mM)的咖啡因量 在体内 环境中是致命的。如果将药物用于急性肌肉力量的药物筛查,则需要考虑药物对全身的影响(例如,肾脏/肝脏应激)以及随后分泌到循环中的因素23.第三,如上所述,使用最大电神经刺激偏离了自愿招募策略,因此不能反映可能由于神经肌肉募集适应引起的力量变化。
在 建立用于实验观察的特定机制方面,体内扭矩测量也可能受到限制。例如,踝关节的扭矩不仅取决于肌肉的力产生,还取决于肌腱和关节以及结缔组织的特性。此外,力是由肌肉群产生的,特别是猪的跖屈肌(腓肠肌,比目鱼肌和足底肌)和背屈肌(腓肠肌,胫骨和手指肌)。因此,对最大 体内 扭矩数据的解释需要考虑潜在的肌肉结构和解剖学变化,并且仅限于肌肉群,而不是单个肌肉。相关地,肌肉群通常由主要快速和慢肌肉纤维的混合物组成,例如分别位于跖屈肌的腓肠肌和比目鱼肌。收缩性质例如收缩和松弛速率(或达到峰值的收缩时间和半松弛时间)不是使用 体内 与孤立的肌肉制剂(例如 体外 或 原位 测试方案)的纤维型生理学的可靠指标47。孤立的肌肉制剂在了解生物力学参数对肌肉功能的影响方面也更胜一筹,因为可以精确控制肌肉长度等特性;重要的是要强调关节角度 – 扭矩关系并不直接等同于肌肉长度 – 力的关系,因为肌腱(例如,松弛),肌肉(例如,摆动角,肌节重叠)和关节(例如,力矩臂)属性有助于扭矩产生取决于关节角。为此,大型动物 原位 功能测试48 可能是 体内 测试的宝贵补充,请记住, 原位 测试是一个终端实验。目前方案的其他进展,将来可以探索以改善实验发现的机械洞察力包括使用超声B模式成像来测量肌肉和肌腱的结构特性,以及植入肌腱力传感器来测量自愿和电刺激收缩期间的肌肉力49。
该方法的重要性和潜在应用
该协议评估猪背屈肌群的 体内 扭矩产生能力,展示了一种在生理环境中评估肌肉功能增加或丧失的非侵入性方法。由于该方法对猪来说是非终端的,因此它也可用于在疾病进展期间,或在治疗策略之前,期间和之后纵向评估同一受试者的肌肉功能。因此,与独立测量相比,重复测量实验设计可以允许以更大的功率和更少的动物进行稳健的统计比较。此外,骨骼肌功能障碍是各种疾病过程和病症的显着组成部分,例如慢性疾病相关的肌肉萎缩(例如,心力衰竭,肾衰竭,艾滋病,癌症等),肌肉萎缩症,神经退行性疾病(例如,SMA或肌萎缩性侧索硬化症;ALS)、衰老(即肌肉减少症)和药物毒性。骨骼肌功能能力是运动、营养、药物和再生医学治疗等干预措施的关键主要结局指标。因此,本文中描述的可靠地评估猪体内扭矩产生能力 的 方案可用于许多研究应用。它可能有助于获取广泛的动物数据,以翻译开发中的疗法。
The authors have nothing to disclose.
美国陆军医学研究和物资司令部向BTC和SMG提供的工作和数据得到了广泛支持(#MR140099;#C_003_2015_USAISR;#C_001_2018_USAISR);以及退伍军人事务部,退伍军人健康管理局,研发办公室(I21 RX003188)到JAC和Luke Brewster博士。作者感谢USAISR兽医服务和比较病理学分支机构以及UMN高级临床前成像中心在完成这些研究方面的技术援助。
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |