Das vorliegende Protokoll beschreibt prägnante experimentelle Details zur Auswertung und Interpretation von In-vivo-Drehmomentdaten , die durch elektrische Stimulation des gemeinsamen Peronealnervs bei betäubten Schweinen gewonnen werden.
Eine zuverlässige Beurteilung der Stärke der Skelettmuskulatur ist wohl das wichtigste Ergebnismaß in neuromuskulären und muskuloskelettalen Erkrankungen und Verletzungsstudien, insbesondere bei der Bewertung der Wirksamkeit regenerativer Therapien. Darüber hinaus ist ein kritischer Aspekt bei der Übersetzung vieler regenerativer Therapien der Nachweis der Skalierbarkeit und Wirksamkeit in einem großen Tiermodell. Verschiedene physiologische Präparate wurden etabliert, um intrinsische Muskelfunktionseigenschaften in grundlegenden wissenschaftlichen Studien, vor allem in Kleintiermodellen, zu bewerten. Die Praktiken können kategorisiert werden als: in vitro (isolierte Fasern, Faserbündel oder ganzer Muskel), in situ (Muskeln mit intakter Vaskularisation und Innervation, aber distale Sehne, die an einem Kraftaufnehmer befestigt sind) und in vivo (Strukturen des Muskels oder der Muskeleinheit bleiben intakt). Jede dieser Vorbereitungen hat Stärken und Schwächen; Ein klarer Vorteil der In-vivo-Festigkeitsprüfung ist jedoch die Möglichkeit, wiederholte Messungen am selben Tier durchzuführen. Hierin werden die Materialien und Methoden zur zuverlässigen Beurteilung des isometrischen Drehmoments vorgestellt, das von den dorsiflexormuskeln der Hintergliedmaßen in vivo als Reaktion auf die peroneale elektrische Standardstimulation bei anästhesierten Schweinen erzeugt wird.
Die Hauptfunktion der Skelettmuskulatur besteht darin, Kraft zu erzeugen, die letztendlich Aktivitäten wie Atmen, Essen und Gehen ermöglicht. Zustände, die die Funktionsfähigkeit der Skelettmuskulatur verringern, können zu einer verminderten Leistung (Beruf oder Sport), einer Behinderung oder zum Tod führen. Zum Beispiel ist die Aufrechterhaltung der Muskelmasse und -funktion in alternden Bevölkerungen positiv mit der Lebensqualität und der Fähigkeit verbunden, grundlegende und instrumentelle Aktivitäten des täglichen Lebens auszuführen 1,2. Und die abnehmende Muskelkraft bei Duchenne-Muskeldystrophie-Patienten führt zu Gehunfähigkeit und Atemversagen, was letztendlich zu einer vorzeitigen Mortalität beiträgt 3,4,5. Daher ist die Messung der Muskelkraft ein kritisches Ergebnismaß in Studien mit neuromuskulären Erkrankungen oder Verletzungen.
Das maximale freiwillige isometrische oder isokinetische Drehmoment (und/oder Ermüdungsindex) wird in klinischen Studien häufig als Index der funktionellen Kapazitätverwendet 6. In Tierversuchen können analoge Messungen in vivo mittels elektrischer Nervenstimulation unter Narkose durchgeführt werden. Insbesondere sind In-vivo-Präparate minimal-invasiv, wobei Muskulatur, Sehnen, Gefäße und Innervation intakt bleiben und daher wiederholte funktionelle Bewertungen 7,8,9,10,11 ermöglichen. Dieses Präparat wird häufig in kleinen Nagetiermodellen und in geringerem Maße in größeren Tiermodellen wie Kaninchen 12, Hunden 13,14, Schafen 15 und Schweinen16,17 verwendet. Die allgemeine Anwendung einer solchen Methodik könnte sich auf viele translationale Forschungsstudien auswirken, z. B. in gentechnisch veränderten Schweinemodellen (Schweinemodellen der spinalen Muskelatrophie (SMA)18. Hierin werden Methoden zur Beurteilung des durch Nervenstimulation induzierten maximalen isometrischen Drehmoments der porcinen dorsiflexormuskelgruppe in vivo vorgestellt. Die vorgestellten Techniken wurden zunächst von den ursprünglich entwickelten Techniken zur Beurteilung des Vordermuskeldrehmoments der Maus19,20 angepasst und anschließend durch Erfahrung bei der Untersuchung der Drehmomentproduktionskapazität nach einer Verletzungverfeinert 17,21,22,23,24,25,26,27,28 und während der Entwicklung16 in verschiedenen Schweinemodellen.
Dieses Protokoll hebt die isometrische In-vivo-Drehmomentmessung unter Verwendung einer Methodik hervor, die einen Computer erfordert, der in eine Wägezelle und einen elektrischen Stimulator integriert ist. Die hier vorgestellten Verfahren verwenden eine handelsübliche integrierte Swine Isometric Footplate Test Apparatus, Plattformapparatur und entsprechende Software (siehe Materialverzeichnis). Die Methodik kann jedoch angepasst werden, um andere kommerziell verfügbare oder maßgeschneiderte Software, Datenerfassungsgeräte und Stimulatoren zu verwenden. Diese Methoden sind für den Einsatz in einem speziellen großen Tierchirurgiesaal vorgesehen, der mit Standardausrüstung ausgestattet ist, wie z. B.: verriegelbarer OP-Tisch, zweiter Verriegelungstisch gleicher Höhe für die Testplattform, Beatmungs- und Überwachungsgeräte sowie Heizmatte oder andere Geräte zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur.
Die folgenden Teammitglieder werden benötigt, um diese Methoden durchzuführen: ein qualifizierter Anästhesietechniker und zwei Studienmitarbeiter, um die Funktionstests durchzuführen. Diese Menschen werden gemeinsam an der anfänglichen Stabilisierung der Extremität auf dem Plattformapparat arbeiten. Dann wird eines der beiden Mitarbeiter für die Platzierung / Positionierung der Elektroden und das andere für die Computeranwendungen während der Tests verantwortlich sein.
Kritische Schritte, Änderungen und Fehlerbehebung
Um die Datenvariabilität zu minimieren und den Erfolg des Ansatzes zu maximieren, werden die folgenden kritischen Schritte hervorgehoben.
Optimale Nervenstimulation
Dieser experimentelle Ansatz beginnt mit der Depolarisation des Nervenaxons und beruht auf der korrekten Platzierung der Elektroden und einer optimierten elektrischen Stimulation. Eine Post-mortem-Analyse der Nervenanatomie im Zusammenhang mit Boney-Landmarken kann helfen, die richtige Elektrodenplatzierung während des Tests zu visualisieren. Die Erfassung des maximalen Zuckungsmoments hilft bei der Bestimmung des geeigneten Stroms (in Milliampere; mA), der an das Nervenaxon abgegeben wird. Es gibt zwei Werte, die bei der Optimierung der Nervenstimulation zu Beginn der Prüfung zu beachten sind: (1) das Verhältnis von Zucken zu Tetanen beträgt ~1:5, z. B. entspricht das Zuckungsmoment ~2 N·m einem Tetanmoment von 10 N·m (Abbildung 3); und (2) das typische Drehmoment zur Körpermasse beträgt ~0,3 N·m pro kg Körpermasse (Abbildung 4). Wenn die Spitzenzuckungsmomente niedrig erscheinen, entfernen Sie die Elektroden und versuchen Sie eine andere Platzierung. Überprüfen Sie unbedingt die Stimulatoreinstellungen, BNC-Anschlüsse und Elektrodenanschlüsse. Eine Elektrodenverlegung kann zwischen den Kontraktionen erforderlich sein, wenn sich während der Positionierung der Extremität zwischen den Gelenkwinkeln zu viel Bewegung bewegt, wie oben erwähnt (Abbildung 2). Bitte beachten Sie, dass experimentelle und interventionelle Ansätze diese Werte beeinflussen können.
Richtige biomechanische Ausrichtung
Die beginnende Muskellänge beeinflusst die Muskelkontraktionskraft (die Länge-Spannungs-Beziehung), und die Muskellänge kann sich basierend auf der Ausrichtung von Hüfte, Knie und Sprunggelenk ändern. Die Gelenkwinkel müssen zwischen den Gliedmaßen und zwischen Schweinen standardisiert werden. Ein 90° Sprunggelenkswinkel wird für Hüfte und Knie dringend empfohlen. Eine leicht plantarflexierte Knöchelposition (~30° aus dem neutralen 0° Sprunggelenkwinkel) ist optimal für Spitzenfestigkeit. Es spiegelt die natürliche anatomische Position des Sprunggelenks sowohl bei Schweinen als auch bei Hunden im Stehen wider. Alle Gelenke sollten auch parallel zu den Fußpedal- und Drehmomentaufnehmern verlaufen, um einen Verlust des messbaren Drehmoments durch den Beitrag eines senkrechten Drehmomentvektors zu vermeiden. Es wird dringend empfohlen, die Hüft-Knie-Sprunggelenkswinkel und die Fuß-Pedal-Gelenk-Ausrichtung zu überprüfen, nachdem der Fuß am Fußpedal befestigt und das Kniegelenk mit den Gliedmaßenklemmstangen gesichert wurde (Abbildung 1). Wenn es eine Fehlausrichtung gibt, entriegeln und entfernen Sie die Stangen und positionieren Sie das Schwein auf dem OP-Tisch neu. Während die Standardisierung der Gelenkwinkel über Studien hinweg für die Minimierung der Datenvarianz von entscheidender Bedeutung ist, gibt es Einschränkungen der biomechanischen Ausrichtung, die im Folgenden erörtert werden.
Bedeutung in Bezug auf bestehende oder alternative Methoden
Alternative Beispiele für klinisch relevante und nicht-invasive Bewertungen der Muskelfunktion, die für Schweinemodelle verwendet werden könnten, sind Laufband-Gehweg, EMG und aktive Muskelscherwellen-Elektrographie. Wie der 6-minütige Gehtest beim Menschen kann ein Laufband-Gehtest das Fortschreiten der Krankheit und den Interventionserfolg bei großen Tierenbewerten 33,34,35. Typischerweise werden Tiere nach einer Akklimatisierungsphase bis zum Ende der Compliance bei verschiedenen Laufbandgeschwindigkeiten und / oder Steigungsniveaus geführt. Essensbelohnungen sind oft notwendig, um maximale Motivation zu erreichen. Die Laufband-Gehergebnisse bieten jedoch nur indirekte Interpretationen der Muskelkontraktilfunktion aufgrund von Einschränkungen wie der Motivation der Probanden, der Rekrutierung nicht maximaler motorischer Einheiten und der inhärenten Co-Abhängigkeit von anderen Körpersystemen wie dem Herz-Kreislauf-, Skelett- und Atmungssystem.
Auf der anderen Seite bietet EMG eine etwas bessere direkte Beurteilung des Skelettmuskelsystems, da EMG-Elektroden direkt auf der interessierenden Muskelgruppe36,37,38 platziert werden. EMG-Elektroden messen dann die kollektive Muskelaktivität (depolarisierte Muskelfasern). Diese Muskelaktivität basiert auf der Rekrutierung motorischer Einheiten und der Ratencodierung (der Häufigkeit von Aktionspotentialen, die an rekrutierte motorische Einheiten gesendet werden). Es ist jedoch unmöglich, die relativen Beiträge der Rekrutierung motorischer Einheiten von der Ratencodierung mit dem Oberflächen-EMG zu trennen. Darüber hinaus stützt sich EMG auf die Bereitschaft des Subjekts, maximale Kontraktionen zu erzeugen, und dieses Maß an Kooperation ist in Großtiermodellen unwahrscheinlich. Während es informativ sein kann, Veränderungen des EMG während des Gangzyklus zu beurteilen, stellen diese Daten keine maximale Funktionsfähigkeit der interessierenden Skelettmuskelgruppe dar. Ultraschallbasierte Bildgebung mit B-Modus und Scherwellenelastographie ist eine weitere nicht-invasive Modalität, die zur Beurteilung der Muskelfunktion verwendet wird. Es besteht eine gute Korrelation zwischen dem elastographisch gemessenen Elastizitätsmodul von Young und den zunehmenden Muskelbelastungen39,40. Die Shearwellen-Elastographie wurde validiert und als quantitatives Maß für die passive Gewebesteifigkeit 41,42,43,44,45 verwendet, einschließlich in einem porcinen volumetrischen Muskelverlustverletzungsmodell 23. Es kann auch als indirekte Messung der aktiven Muskelkraftproduktionverwendet werden 39. Es gibt jedoch nach wie vor EMG-ähnliche Einschränkungen für die Bereitschaft des Subjekts und die Zusammenarbeit zur Durchführung von Kontraktionen.
Das hier beschriebene In-vivo-Protokoll bietet im Gegensatz zu Laufband-Gehdistanz und EMG eine zuverlässige, reproduzierbare und maximale Beurteilung der Muskelfunktion. Dieses Protokoll ruft Muskelkontraktionen in einer kontrollierten, quantifizierbaren Weise hervor, die unabhängig von der Motivation ist. Insbesondere werden perkutane Elektroden verwendet, um Nervenaxone zu stimulieren, die das zentrale Nervensystem umgehen. Die Depolarisation der Nervenaxone greift alle motorischen Einheiten ein und eliminiert die Variabilität, die mit der Rekrutierung von Motoreinheiten verbunden ist. Zusätzlich kontrolliert der Prüfarzt die Ratencodierung (Stimulationsfrequenz). Die resultierende neuromuskuläre Physiologie, die auf diesen Ansatz angewendet wird, beginnt mit einer spannungsgesteuerten Natriumkanalaktivierung an den Knoten von Ranvier. Die gesamte nachfolgende (oder nachgeschaltete) Physiologie wird einbezogen, einschließlich der Anregungs-Kontraktions-Kopplung und des Cross-Bridge-Cyclings. Ein wesentlicher Vorteil der nicht-invasiven In-vivo-Muskelanalyse besteht darin, dass die kontraktile Muskelfunktion wiederholt gemessen werden kann, beispielsweise wöchentlich, um die Muskelkraft nach einer Verletzung, einem Eingriff oder einem Krankheitsverlauf zu überwachen.
Einschränkungen der Methode
Die in diesem Protokoll beschriebene In-vivo-Ausrüstung ermöglicht ein passives und aktives isometrisches Drehmoment in Abhängigkeit von Gelenkwinkel und Stimulationsfrequenz. Die verwendete Prüfvorrichtung unterstützt nicht die Messung dynamischer Kontraktionen (z. B. isokinetische exzentrische oder konzentrische Kontraktionen). Die Vorrichtung ermöglicht einen Bewegungsbereich von 105° zur Charakterisierung der Drehmoment-Gelenkwinkel-Beziehung und verwendet eine Wägezelle mit einem maximalen Drehmomentbereich von ~50 N·m. Spezifische experimentelle Fragen können Leistungsmerkmale außerhalb dieser Spezifikationen erfordern. Insbesondere kann die Wägezelle dieser beschriebenen Vorrichtung bei Bedarf gegen größere Drehmomentbereiche ausgetauscht werden.
Das hierin beschriebene Protokoll zur Messung der maximalen neuromuskulären Stärke in vivo weist bemerkenswerte Einschränkungen auf. Erstens erfordert diese Methode eine Anästhesie, die je nach Tiereinrichtungsprotokollen und -ressourcen unterschiedlich durchgeführt werden kann. Es ist bekannt, dass Anästhetika unterschiedliche Auswirkungen auf die neuromuskuläre Funktion haben und es wurde gezeigt, dass sie die dorsiflexorische Drehmomentproduktion der Maus in vivo in anästhetischer und dosisabhängiger Weise verändern29. Die unterschiedlichen Wirkungen von Anästhetika auf das In-vivo-Drehmoment von Großtieren sind unklar; Daher müssen Kontroll- und Versuchsgruppen über die gleichen Anästhesiemittel verfügen (z. B. alle Gruppen, denen Ketamin verabreicht wird), um diese Variabilität zu kontrollieren. Zweitens schränkt die Abhängigkeit von In-vivo-Diffusionsmustern die Erforschung zellulärer Mechanismen der kontraktilen Dysfunktion und der akuten Arzneimitteltoxizität ein. Zum Beispiel kann Koffein während des In-vitro-Organbadtests eines isolierten Muskels verwendet werden, um die sarkoplasmatische Retikulum-Kalziumfreisetzung zu stimulieren, wobei die Erregungs-Kontraktions-Kopplung46 direkt umgangen wird. Die Menge an Koffein, die diesen Effekt induziert (mM), ist in einer In-vivo-Umgebung tödlich. Arzneimitteleinflüsse auf den gesamten Körper (z. B. Nieren- / Leberstress) und nachfolgende Faktoren, die in den Kreislauf ausgeschieden werden, müssen berücksichtigt werden, wenn dieser Ansatz für das Drogenscreening auf akute Muskelkraftverwendet wird 23. Drittens weicht die Verwendung der maximalen elektrischen Nervenstimulation von freiwilligen Rekrutierungsstrategien ab, wie oben diskutiert, und spiegelt daher keine Kraftveränderungen wider, die auf neuromuskuläre Rekrutierungsanpassungen zurückzuführen sein können.
In-vivo-Drehmomentmessungen können auch im Hinblick auf die Festlegung eines spezifischen Mechanismus für experimentelle Beobachtungen eingeschränkt werden. Zum Beispiel hängt das Drehmoment um das Sprunggelenk nicht nur von der Muskelkraftproduktion ab, sondern auch von der Sehnen- und Gelenk- und Bindegewebseigenschaft. Darüber hinaus wird Kraft von Muskelgruppen erzeugt, insbesondere von den Plantarbeugern (Musculus gastrocnemius, Soleus und Plantais) und den Dorsiflexoren (Peroneus tertius, Tibialis und Digitorummuskeln) bei Schweinen. Daher erfordern Interpretationen von maximalen In-vivo-Drehmomentdaten die Berücksichtigung potenzieller muskulotendinöser und anatomischer Veränderungen und beschränken sich auf Muskelgruppen, nicht auf einzelne Muskeln. In diesem Zusammenhang bestehen Muskelgruppen oft aus einer Mischung von überwiegend schnellen und langsamen Muskelfasern, wie dem Gastrocnemius- bzw. Soleus-Muskel der Plantarbeuger. Kontraktile Eigenschaften wie Kontraktions- und Entspannungsrate (oder Time-to-Peak-Kontraktion und Halbrelaxationszeit) sind keine zuverlässigen Indikatoren für die Faserphysiologie, die in vivo im Vergleich zu isolierten Muskelpräparaten wie In-vitro- oder In-situ-Testprotokollen verwendet wird 47. Isolierte Muskelpräparate sind auch beim Verständnis des Einflusses biomechanischer Parameter auf die Muskelfunktion überlegen, da Eigenschaften wie die Muskellänge präzise gesteuert werden können. Es ist wichtig zu betonen, dass die Gelenkwinkel-Drehmoment-Beziehung nicht direkt äquivalent zur Muskellänge-Kraft-Beziehung ist, da die Eigenschaften von Sehnen (z. B. Slack), Muskeln (z. B. Pennationswinkel, Sarkomerüberlappung) und Gelenken (z. B. Momentarm), die zur Drehmomentproduktion beitragen, vom Gelenkwinkel abhängen. Zu diesem Zweck könnten In-situ-Funktionstests48 für Großtiere eine wertvolle Ergänzung zu In-vivo-Tests sein, wenn man bedenkt, dass In-situ-Tests ein terminales Experiment sind. Andere Weiterentwicklungen des aktuellen Protokolls, die in Zukunft untersucht werden könnten, um die mechanistischen Erkenntnisse experimenteller Ergebnisse zu verbessern, umfassen die Verwendung von Ultraschall-B-Mode-Bildgebung zur Messung der architektonischen Eigenschaften von Muskeln und Sehnen und die Implantation eines Sehnenkraftwandlers zur Messung der Muskelkraft während freiwilliger und elektrisch stimulierter Kontraktionen49.
Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten der Methode
Dieses Protokoll bewertet die in vivo Drehmomentproduktionskapazität der porcinen Dorsalflexor-Muskelgruppe und demonstriert eine nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Zunahme oder des Verlusts der Muskelfunktion in einer physiologischen Umgebung. Da die Methodik für das Schwein nicht terminal ist, kann sie auch verwendet werden, um die Muskelfunktion bei denselben Probanden längsschnittlich während des Fortschreitens einer Krankheit oder vor, während und nach einer Behandlungsstrategie zu bewerten. Daher kann ein Versuchsdesign mit wiederholten Messungen robuste statistische Vergleiche mit größerer Aussagekraft und weniger Tieren im Vergleich zu unabhängigen Messungen ermöglichen. Darüber hinaus ist die Skelettmuskeldysfunktion ein herausragender Bestandteil verschiedener Krankheitsprozesse und -zustände, wie chronischer krankheitsbedingter Muskelschwund (z. B. Herzinsuffizienz, Nierenversagen, AIDS, Krebs usw.), Muskeldystrophie, neurodegenerative Erkrankungen (z. B. SMA oder amyotrophe Lateralsklerose; ALS), Altern (d. H. Sarkopenie) und Arzneimitteltoxizitäten. Die funktionelle Kapazität der Skelettmuskulatur ist ein kritisches primäres Endergebnis für Interventionen wie Bewegung, Ernährung sowie medikamentöse und regenerative Medizintherapien. Daher kann das hierin beschriebene Protokoll zur zuverlässigen Bewertung der Schweinmomenterzeugungskapazität in vivo in zahlreichen Studienanwendungen verwendet werden. Es kann bei der Gewinnung umfangreicher Tierdaten für die Translation von Entwicklungstherapien hilfreich sein.
The authors have nothing to disclose.
Die vorgelegten Arbeiten und Daten wurden vom US Army Medical Research and Material Command an BTC und SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR) weitgehend unterstützt; und das Department of Veterans Affairs, Veterans Health Administration, Office of Research and Development (I21 RX003188) an JAC und Dr. Luke Brewster. Die Autoren danken dem USAISR Veterinary Service und Comparative Pathology Branches und dem UMN Advanced Preclinical Imaging Center für die technische Unterstützung bei der Durchführung dieser Studien.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |