Le présent protocole décrit des détails expérimentaux concis sur l’évaluation et l’interprétation des données de couple in vivo obtenues par stimulation électrique du nerf péronier commun chez les porcs anesthésiés.
Une évaluation fiable de la force musculaire squelettique est sans doute la mesure de résultat la plus importante dans les études sur les maladies et les blessures neuromusculaires et musculo-squelettiques, en particulier lors de l’évaluation de l’efficacité des thérapies régénératives. En outre, un aspect essentiel de la traduction de nombreuses thérapies régénératives est la démonstration de l’évolutivité et de l’efficacité dans un grand modèle animal. Diverses préparations physiologiques ont été établies pour évaluer les propriétés intrinsèques de la fonction musculaire dans des études scientifiques fondamentales, principalement dans de petits modèles animaux. Les pratiques peuvent être classées comme suit: in vitro (fibres isolées, faisceaux de fibres ou muscle entier), in situ (muscle avec vascularisation et innervation intactes mais tendon distal attaché à un transducteur de force) et in vivo (les structures du muscle ou de l’unité musculaire restent intactes). Il y a des forces et des faiblesses à chacune de ces préparations; cependant, un avantage évident des tests de résistance in vivo est la possibilité d’effectuer des mesures répétées sur le même animal. On y présente les matériaux et les méthodes permettant d’évaluer de manière fiable le couple isométrique produit par les muscles dorsiflexeurs des membres postérieurs in vivo en réponse à la stimulation électrique péronière standard chez les porcs anesthésimés.
La fonction principale du muscle squelettique est de produire de la force, ce qui rend finalement possibles des activités telles que la respiration, l’alimentation et la déambulation. Les conditions qui réduisent la capacité fonctionnelle des muscles squelettiques peuvent entraîner une diminution des performances (professionnelles ou sportives), une invalidité ou la mort. Par exemple, le maintien de la masse musculaire et de la fonction dans les populations vieillissantes est positivement associé à la qualité de vie et à la capacité d’effectuer des activités de base et instrumentales de la vie quotidienne 1,2. De plus, la diminution de la force musculaire chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne entraîne l’incapacité de se déplacer et l’insuffisance respiratoire, contribuant finalement à la mortalité prématurée 3,4,5. Ainsi, la mesure de la force musculaire est une mesure de résultat critique dans les études impliquant une maladie ou une blessure neuromusculaire.
Le couple isométrique ou isocinétique volontaire maximal (et/ou l’indice de fatigue) est souvent utilisé comme indice de capacité fonctionnelle dans les études cliniques6. Dans les études animales, des mesures analogues peuvent être effectuées in vivo en utilisant la stimulation nerveuse électrique sous anesthésie. Notamment, les préparations in vivo sont peu invasives, la musculature, les tendons, le système vasculaire et l’innervation restant intacts et permettent donc des évaluations fonctionnelles répétées 7,8,9,10,11. Cette préparation est couramment utilisée dans les modèles de petits rongeurs et, dans une moindre mesure, dans les modèles animaux plus grands tels que les lapins12, les chiens 13,14, les moutons15 et les porcs 16,17. L’utilisation générale d’une telle méthodologie pourrait avoir un impact sur de nombreuses études de recherche translationnelle, comme dans les modèles génétiquement modifiés d’amyotrophie spinale porcine (porc) (SMA)18. On y présente des méthodes pour évaluer le couple isométrique maximal induit par la stimulation nerveuse du groupe musculaire dorsiflexeur porcin in vivo. Les techniques présentées ont d’abord été adaptées de celles développées à l’origine pour évaluer le couple du muscle crural antérieur de la souris19,20, puis affinées par l’expérience de l’étude de la capacité de production de couple après une blessure 17,21,22,23,24,25,26,27,28 et au cours du développement16 dans divers modèles porcins.
Ce protocole met en évidence la mesure isométrique du couple in vivo à l’aide d’une méthodologie qui nécessite un ordinateur intégré à un capteur de pesage et à un stimulateur électrique. Les méthodes présentées ici utilisent un appareil de test de plaque de pied isométrique porcin intégré disponible dans le commerce, un appareil de plate-forme et un logiciel correspondant (voir tableau des matériaux). Cependant, la méthodologie peut être adaptée pour utiliser d’autres logiciels disponibles dans le commerce ou sur mesure, des dispositifs d’acquisition de données et des stimulateurs. Ces méthodes sont destinées à être utilisées dans une suite chirurgicale dédiée aux grands animaux dotée d’équipements standard tels que: table chirurgicale de verrouillage, deuxième table de verrouillage de hauteur égale pour la plate-forme de test, ventilateur et dispositifs de surveillance, tapis chauffant ou autres dispositifs pour maintenir la température corporelle.
Les membres de l’équipe suivants sont nécessaires pour effectuer ces méthodes: un technicien en anesthésie qualifié et deux membres du personnel de l’étude pour effectuer les tests fonctionnels. Ces personnes travailleront ensemble pour la stabilisation initiale du membre sur l’appareil de plate-forme. Ensuite, l’un des deux membres du personnel sera responsable du placement/positionnement de l’électrode et l’autre des applications informatiques pendant les essais.
Étapes critiques, modifications et dépannage
Pour minimiser la variabilité des données et maximiser le succès de l’approche, les étapes critiques suivantes sont mises en évidence.
Stimulation nerveuse optimale
Cette approche expérimentale commence par la dépolarisation des axones nerveux et repose sur un placement correct des électrodes et une stimulation électrique optimisée. Une analyse post-mortem de l’anatomie nerveuse liée aux repères osseux peut aider à visualiser le placement approprié des électrodes pendant les tests. L’acquisition d’un couple de contraction maximal aide à déterminer le courant approprié (en milliampères; mA) délivré à l’axone nerveux. Il y a deux valeurs à garder à l’esprit lors de l’optimisation de la stimulation nerveuse au début des tests : (1) le rapport contraction/tétanique est d’environ 1:5, par exemple, ~2 N·m de couple de contraction correspond à un couple tétanique de 10 N·m (Figure 3) ; et (2) le couple typique par rapport à la masse corporelle est d’environ 0,3 N·m par kg de masse corporelle (figure 4). Si les couples de contraction de crête semblent faibles, retirez les électrodes et tentez un autre placement. Assurez-vous de vérifier les paramètres du stimulateur, les connexions BNC et les connexions d’électrodes. Le remplacement de l’électrode peut être nécessaire entre les contractions s’il y a trop de mouvement lors du positionnement du membre entre les angles articulaires, comme indiqué ci-dessus (Figure 2). Veuillez noter que les approches expérimentales et interventionnelles pourraient avoir une incidence sur ces valeurs.
Alignement biomécanique approprié
La longueur musculaire de départ influence la force contractile musculaire (la relation longueur-tension), et la longueur musculaire peut changer en fonction de l’alignement des articulations de la hanche, du genou et de la cheville. Les angles articulaires doivent être normalisés entre les membres et entre les porcs. Un angle d’articulation de la cheville de 90° est fortement recommandé pour la hanche et le genou. Une position de cheville légèrement plantaire (~ 30 ° de l’angle neutre de l’articulation de la cheville de 0 °) est optimale pour une force maximale. Il reflète la position anatomique naturelle de l’articulation de la cheville chez les porcs et les chiens debout. Toutes les articulations doivent également être parallèles à la pédale et aux capteurs de couple afin d’éviter toute perte de couple mesurable due à la contribution d’un vecteur de couple perpendiculaire. Il est fortement recommandé d’inspecter les angles articulaires hanche-genou-cheville et l’alignement pied-pédale-articulation après avoir fixé le pied à la pédale et fixé l’articulation du genou avec les barres de serrage des membres (Figure 1). En cas de désalignement, déverrouillez et retirez les barres et repositionnez le cochon sur la table chirurgicale. Bien que la normalisation des angles communs entre les études soit essentielle pour minimiser la variance des données, il existe des limites à l’alignement biomécanique qui sont notables, discutées ci-dessous.
Importance par rapport aux méthodes existantes ou alternatives
Des exemples alternatifs d’évaluations cliniquement pertinentes et non invasives de la fonction musculaire qui pourraient être utilisées pour les modèles porcins comprennent la distance de marche sur tapis roulant, l’EMG et l’électrographie active des ondes de cisaillement musculaire. Comme le test de marche de 6 minutes chez l’homme, un test de marche sur tapis roulant peut évaluer la progression de la maladie et le succès de l’intervention chez les grands animaux 33,34,35. En règle générale, après une période d’acclimatation, les animaux sont promenés jusqu’à la fin de la conformité à différentes vitesses de tapis roulant et / ou niveaux d’inclinaison. Les récompenses alimentaires sont souvent nécessaires pour atteindre une motivation maximale. Cependant, les résultats de la marche sur tapis roulant n’offrent que des interprétations indirectes de la fonction contractile musculaire en raison de limitations telles que la motivation du sujet, le recrutement non maximal de l’unité motrice et la co-dépendance inhérente à d’autres systèmes corporels tels que les systèmes cardiovasculaire, squelettique et respiratoire.
D’autre part, l’EMG offre une évaluation directe légèrement meilleure du système musculaire squelettique, car les électrodes EMG sont placées directement sur le groupe musculaire d’intérêt 36,37,38. Les électrodes EMG mesurent ensuite l’activité musculaire collective (fibres musculaires dépolarisées). Cette activité musculaire est basée sur le recrutement des unités motrices et le codage des taux (la fréquence des potentiels d’action envoyés aux unités motrices recrutées). Cependant, il est impossible de séparer les contributions relatives du recrutement des unités motrices par rapport au codage du taux avec l’EMG de surface. En outre, EMG repose sur la volonté du sujet de générer des contractions maximales, et ce niveau de coopération est peu probable dans les modèles de gros animaux. Bien qu’il puisse être instructif d’évaluer les changements dans l’EMG au cours du cycle de marche, ces données ne représentent pas une capacité fonctionnelle maximale du groupe musculaire squelettique d’intérêt. L’imagerie par ultrasons utilisant le mode B et l’élastographie par ondes de cisaillement est une autre modalité non invasive utilisée pour évaluer la fonction musculaire. Il existe une bonne corrélation entre le module de Young mesuré par élastographie et l’augmentation de la charge musculaire39,40. L’élastographie par ondes de cisaillement a été validée et utilisée comme mesure quantitative de la rigidité passive des tissus 41,42,43,44,45, y compris dans un modèle de lésion de perte musculaire volumétrique porcinemodèle 23. Il peut également être utilisé comme mesure indirecte de la production de force musculaire active39. Cependant, des limitations similaires à l’EMG pour la volonté et la coopération du sujet d’effectuer des contractions sont toujours présentes.
Le protocole in vivo décrit ici, contrairement à la distance de marche sur tapis roulant et à l’EMG, fournit une évaluation fiable, reproductible et maximale de la fonction musculaire. Ce protocole évoque les contractions musculaires d’une manière contrôlée, quantifiable et indépendante de la motivation. Plus précisément, les électrodes percutanées sont utilisées pour stimuler les axones nerveux en contournant le système nerveux central. La dépolarisation des axones nerveux engage toutes les unités motrices en éliminant la variabilité associée au recrutement des unités motrices. De plus, l’investigateur contrôle le codage de la vitesse (fréquence de stimulation). La physiologie neuromusculaire résultante qui s’applique à cette approche commence par l’activation du canal sodique voltage-dépendant aux nœuds de Ranvier. Toute la physiologie ultérieure (ou en aval) est engagée, y compris le couplage excitation-contraction et le cycle de pont transversal. Un avantage significatif de l’analyse musculaire non invasive in vivo est que la fonction musculaire contractile peut être mesurée à plusieurs reprises, par exemple chaque semaine, pour surveiller la force musculaire après une blessure, une intervention ou une progression de la maladie.
Limites de la méthode
L’équipement in vivo décrit dans ce protocole permet un couple isométrique passif et actif en fonction de l’angle articulaire et de la fréquence de stimulation. L’appareil d’essai utilisé ne permet pas de mesurer les contractions dynamiques (p. ex. contractions isocinétiques excentriques ou concentriques). L’appareil permet une amplitude de mouvement de 105 ° pour caractériser la relation couple-angle d’articulation et utilise un capteur de charge avec une plage de couple maximale d’environ 50 N·m. Des questions expérimentales spécifiques peuvent nécessiter des caractéristiques de performance en dehors de ces spécifications. Notamment, le capteur de pesage de cet appareil décrit peut être remplacé par des plages de couple plus élevées si nécessaire.
Le protocole décrit ici pour mesurer la force neuromusculaire maximale in vivo présente des limites notables. Tout d’abord, cette méthode nécessite une anesthésie, qui peut être menée différemment selon les protocoles et les ressources de l’animalerie. Les anesthésiques sont connus pour avoir des effets variables sur la fonction neuromusculaire et il a été démontré qu’ils modifient la production de couple dorsiflexeur in vivo chez la souris de manière anesthésique et dose-dépendante29. Les effets différentiels des anesthésiques sur le couple in vivo des gros animaux ne sont pas clairs; par conséquent, les groupes témoins et expérimentaux doivent avoir les mêmes agents anesthésiques (p. ex., tous les groupes ayant reçu de la kétamine) pour contrôler cette variabilité. Deuxièmement, le recours à des modèles de diffusion in vivo limite l’exploration des mécanismes cellulaires de la dysfonction contractile et des toxicités aiguës des médicaments. Par exemple, la caféine peut être utilisée lors de tests in vitro de bain d’organes sur un muscle isolé pour stimuler la libération de calcium du réticulum sarcoplasmique, en contournant directement le couplage excitation-contraction46 . La quantité de caféine pour induire cet effet (mM) est mortelle dans un contexte in vivo . Les influences des médicaments sur l’ensemble du corps (p. ex., le stress rénal et hépatique) et les facteurs subséquents sécrétés dans la circulation devront être pris en compte si cette approche est utilisée pour le dépistage des médicaments sur la force musculaire aiguë23. Troisièmement, l’utilisation de la stimulation nerveuse électrique maximale s’écarte des stratégies de recrutement volontaire, comme indiqué ci-dessus, et ne reflète donc pas les changements de force qui peuvent être dus à des adaptations du recrutement neuromusculaire.
Les mesures de couple in vivo peuvent également être limitées en ce qui concerne l’établissement d’un mécanisme spécifique pour les observations expérimentales. Par exemple, le couple autour de l’articulation de la cheville dépend non seulement de la production de force musculaire, mais aussi des propriétés du tendon et de l’articulation et du tissu conjonctif. De plus, la force est générée par des groupes de muscles, en particulier les fléchisseurs plantaires (muscles gastrocnémius, soleus et plantaris) et les muscles dorsiflexeurs (peroneus tertius, tibialis et digitorum muscles) chez les porcs. Par conséquent, les interprétations des données de couple maximal in vivo nécessitent la prise en compte des changements musculo-tendineux et anatomiques potentiels et sont limitées aux groupes musculaires, et non aux muscles individuels. Dans le même ordre d’idées, les groupes musculaires sont souvent constitués d’un mélange de fibres musculaires principalement rapides et lentes, telles que le muscle gastrocnémien et le muscle soléaire, respectivement, des fléchisseurs plantaires. Les propriétés contractiles telles que le taux de contraction et de relaxation (ou le temps de contraction jusqu’au pic et le temps de demi-relaxation) ne sont pas des indicateurs fiables de la physiologie de type fibre utilisant des préparations musculaires in vivo par rapport à des préparations musculaires isolées, telles que les protocoles de test in vitro ou in situ 47. Les préparations musculaires isolées sont également supérieures pour comprendre l’influence des paramètres biomécaniques sur la fonction musculaire, car des propriétés telles que la longueur musculaire peuvent être contrôlées avec précision; il est important de souligner que la relation angle-couple articulaire n’est pas directement équivalente à la relation longueur-force musculaire, car les propriétés tendineuses (p. ex., relâchement), musculaire (p. ex., angle de pennation, chevauchement du sarcomère) et articulaire (p. ex., bras moment) qui contribuent à la production de couple dépendent de l’angle articulaire. À cette fin, les tests fonctionnels in situ sur de grands animaux48 pourraient être un ajout précieux aux tests in vivo, en gardant à l’esprit que les tests in situ sont une expérience terminale. D’autres avancées du protocole actuel qui pourraient être explorées à l’avenir pour améliorer la vision mécaniste des résultats expérimentaux comprennent l’utilisation de l’imagerie par ultrasons en mode B pour mesurer les propriétés architecturales des muscles et des tendons et l’implantation d’un transducteur de force tendineuse pour mesurer la force musculaire pendant les contractions volontaires et stimulées électriquement49.
Importance et applications potentielles de la méthode
Ce protocole évalue la capacité de production de couple in vivo du groupe musculaire dorsiflexeur porcin, démontrant une méthode non invasive pour évaluer le gain ou la perte de la fonction musculaire dans un cadre physiologique. Parce que la méthodologie n’est pas terminale pour le porc, elle peut également être utilisée pour évaluer la fonction musculaire chez les mêmes sujets longitudinalement pendant la progression d’une maladie, ou avant, pendant et après une stratégie de traitement. En tant que tel, une conception expérimentale de mesures répétées peut permettre des comparaisons statistiques robustes avec une plus grande puissance et moins d’animaux par rapport à des mesures indépendantes. De plus, le dysfonctionnement des muscles squelettiques est une composante saillante de divers processus et affections pathologiques, tels que l’atrophie musculaire associée à une maladie chronique (p. ex., insuffisance cardiaque, insuffisance rénale, sida, cancer, etc.), la dystrophie musculaire, les maladies neurodégénératives (p. ex., SMA ou sclérose latérale amyotrophique; SLA), le vieillissement (c.-à-d. sarcopénie) et les toxicités médicamenteuses. La capacité fonctionnelle des muscles squelettiques est une mesure de critère de jugement primaire essentielle pour des interventions telles que l’exercice, la nutrition et les thérapies médicamenteuses et régénératives. Ainsi, le protocole décrit ici pour évaluer de manière fiable la capacité de production de couple porcin in vivo peut être utilisé dans de nombreuses applications d’étude. Il peut jouer un rôle déterminant dans l’acquisition de nombreuses données animales pour la traduction de thérapies en développement.
The authors have nothing to disclose.
Les travaux et les données présentés ont été largement soutenus par le US Army Medical Research and Material Command à BTC et SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); et le ministère des Anciens Combattants, l’Administration de la santé des anciens combattants, le Bureau de la recherche et du développement (I21 RX003188) au JAC et au Dr Luke Brewster. Les auteurs remercient les branches du service vétérinaire et de pathologie comparative de l’USAISR et le centre d’imagerie préclinique avancée de l’UMN pour leur assistance technique dans la réalisation de ces études.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |