Detta protokoll beskriver kortfattade experimentella detaljer om utvärdering och tolkning av in vivo vridmomentdata erhållna via elektrisk stimulering av den vanliga peroneala nerven hos sövda grisar.
Tillförlitlig bedömning av skelettmuskelstyrka är utan tvekan det viktigaste resultatmåttet i neuromuskulära och muskuloskeletala sjukdoms- och skadestudier, särskilt vid utvärdering av regenerativa terapiers effekt. Dessutom är en kritisk aspekt av att översätta många regenerativa terapier demonstrationen av skalbarhet och effektivitet i en stordjursmodell. Olika fysiologiska preparat har etablerats för att utvärdera inneboende muskelfunktionsegenskaper i grundvetenskapliga studier, främst i smådjursmodeller. Metoderna kan kategoriseras som: in vitro (isolerade fibrer, fiberbuntar eller hela muskler), in situ (muskel med intakt vaskularisering och innervation men distal sena fäst vid en kraftgivare) och in vivo (strukturer i muskeln eller muskelenheten förblir intakta). Det finns styrkor och svagheter i var och en av dessa förberedelser; En klar fördel med in vivo-hållfasthetstestning är dock förmågan att utföra upprepade mätningar på samma djur. Häri presenteras material och metoder för att på ett tillförlitligt sätt bedöma isometriskt vridmoment som produceras av bakbenets dorsiflexormuskler in vivo som svar på standard peroneal elektrisk stimulering hos bedövade grisar.
Skelettmuskulaturens primära funktion är att producera kraft, vilket i slutändan gör aktiviteter som andning, ätande och ambulerande möjliga. Tillstånd som minskar skelettmuskulaturens funktionsförmåga kan leda till minskad prestation (yrkes- eller sport), funktionshinder eller död. Till exempel är upprätthållandet av muskelmassa och funktion i åldrande befolkningar positivt förknippat med livskvalitet och förmågan att utföra grundläggande och instrumentella aktiviteter i det dagliga livet 1,2. Och minskande muskelstyrka hos Patienter med duchennes muskeldystrofi resulterar i oförmåga att ambulera och andningssvikt, vilket i slutändan bidrar till för tidig dödlighet 3,4,5. Således är mätning av muskelstyrka ett kritiskt resultatmått i studier som involverar neuromuskulär sjukdom eller skada.
Maximalt frivilligt isometriskt eller isokinetiskt vridmoment (och/eller utmattningsindex) används ofta som ett index för funktionsförmåga i kliniska studier6. I djurstudier kan analoga mätningar göras in vivo med hjälp av elektrisk nervstimulering under anestesi. I synnerhet är in vivo-preparat minimalt invasiva med muskulatur, senor, vaskulatur och innervation som förblir intakta och tillåter därför upprepade funktionsbedömningar 7,8,9,10,11. Denna beredning används ofta i modeller av små gnagare och i mindre utsträckning i större djurmodeller som kaniner12, hundar13,14, får15 och grisar16,17. Den allmänna användningen av en sådan metod kan påverka många translationella forskningsstudier, till exempel i genetiskt modifierade svinmodeller av spinal muskelatrofi (SMA)18. Här presenteras metoder för att bedöma nervstimuleringsinducerat maximalt isometriskt vridmoment hos muskelgruppen svin dorsiflexor in vivo. De presenterade teknikerna anpassades ursprungligen från de som ursprungligen utvecklades för att bedöma musens främre cruralmuskelmoment 19,20 och förfinades därefter genom erfarenhet av att undersöka vridmomentproduktionskapacitet efter skada 17,21,22,23,24,25,26,27,28 och under utveckling16 i olika svinmodeller.
Detta protokoll belyser isometrisk momentmätning in vivo med hjälp av metodik som kräver en dator integrerad med en lastcell och elektrisk stimulator. De metoder som presenteras här använder en kommersiellt tillgänglig integrerad svinisometrisk fotplatta testapparat, plattformsapparat och motsvarande programvara (se materialtabell). Metoden kan dock anpassas för att använda annan kommersiellt tillgänglig eller skräddarsydd programvara, datainsamlingsenheter och stimulatorer. Dessa metoder är avsedda att användas i en dedikerad kirurgisk svit för stora djur fylld med standardutrustning som: låsning av kirurgiskt bord, andra låsbord med samma höjd för testplattformen, ventilator och övervakningsanordningar och värmematta eller andra enheter för att upprätthålla kroppstemperaturen.
Följande teammedlemmar behövs för att utföra dessa metoder: en skicklig anestesitekniker och två studiepersonal för att utföra funktionstestningen. Dessa människor kommer att arbeta tillsammans för den första stabiliseringen av lemmen på plattformsapparaten. Därefter kommer en av de två personerna att ansvara för elektrodplaceringen/positioneringen och den andra för datorapplikationerna under testningen.
Kritiska steg, ändringar och felsökning
För att minimera datavariabiliteten och maximera metodens framgång markeras följande kritiska steg.
Optimal nervstimulering
Detta experimentella tillvägagångssätt börjar med nervaxondepolarisering och förlitar sig på korrekt elektrodplacering och optimerad elektrisk stimulering. En post-mortem-analys av nervanatomi relaterad till beniga landmärken kan hjälpa till att visualisera korrekt elektrodplacering under testningen. Att få maximalt ryckmoment hjälper till att bestämma lämplig ström (i milliampere; mA) som levereras till nervaxonen. Det finns två värden att tänka på när du optimerar nervstimulering i början av testningen: (1) förhållandet mellan ryck och tetan är ~ 1: 5, t.ex. ~ 2 N · m ryckmoment motsvarar ett 10 N · m tetaniskt vridmoment (figur 3); och (2) det typiska vridmomentet till kroppsmassan är ~ 0,3 N · m per kg kroppsmassa (figur 4). Om de högsta ryckmomenten verkar låga, ta bort elektroderna och försök med en annan placering. Var noga med att kontrollera stimulatorinställningar, BNC-anslutningar och elektrodanslutningar. Elektrodomplacering kan behövas mellan sammandragningar om det finns för mycket rörelse under placeringen av lemmen mellan ledvinklarna, som nämnts ovan (figur 2). Observera att experimentella och interventionella tillvägagångssätt kan påverka dessa värden.
Korrekt biomekanisk inriktning
Start av muskellängd påverkar muskelkontraktil kraft (förhållandet mellan längd och spänning), och muskellängden kan förändras baserat på höft-, knä- och fotledsinriktning. Fogvinklarna måste standardiseras mellan lemmar och bland grisar. En 90° fotledsvinkel rekommenderas starkt för höft och knä. En lätt plantarflexerad fotledsposition (~ 30 ° från den neutrala 0 ° fotledsvinkeln) är optimal för toppstyrka. Det återspeglar fotledens naturliga anatomiska position hos både grisar och hundar när de står. Alla fogar bör också vara parallella med fotpedalen och vridmomentgivarna för att undvika förlust av mätbart vridmoment på grund av bidraget från en vinkelrät vridmomentvektor. Inspektion av höft-knä-fotledsvinklarna och fot-pedal-led-inriktning rekommenderas starkt efter att foten har fästs vid fotpedalen och säkrat knäleden med lemklämmorna (figur 1). Om det finns felinriktning, lås upp och ta bort stängerna och placera om grisen på operationsbordet. Även om standardisering av gemensamma vinklar över studier är avgörande för att minimera datavariansen, finns det begränsningar för biomekanisk inriktning som är anmärkningsvärda, som diskuteras nedan.
Betydelse med avseende på befintliga eller alternativa metoder
Alternativa exempel på kliniskt relevanta och icke-invasiva bedömningar av muskelfunktion som kan användas för svinmodeller inkluderar löpbandsavstånd, EMG och aktiv muskelskjuvvågselektrografi. Som 6 minuters gångtest hos människor kan ett löpbandsvandringstest utvärdera sjukdomsprogression och interventionsframgång hos stora djur 33,34,35. Vanligtvis, efter en acklimatiseringsperiod, går djur till slutet av efterlevnaden vid olika löpbandshastigheter och / eller lutningsnivåer. Matbelöningar är ofta nödvändiga för att uppnå maximal motivation. Löpbandsvandringsresultat erbjuder dock endast indirekta tolkningar av muskelkontraktil funktion på grund av begränsningar som ämnesmotivation, icke-maximal rekrytering av motoriska enheter och inneboende samberoende av andra kroppssystem som hjärt-, skelett- och andningsorganen.
Å andra sidan erbjuder EMG en något bättre direkt bedömning av skelettmuskelsystemet, eftersom EMG-elektroder placeras direkt på muskelgruppen av intresse 36,37,38. EMG-elektroder mäter sedan den kollektiva muskelaktiviteten (depolariserade muskelfibrer). Denna muskelaktivitet är baserad på rekrytering av motorenheter och hastighetskodning (frekvensen av åtgärdspotentialer som skickas till rekryterade motorenheter). Att separera de relativa bidragen från rekrytering av motorenheter kontra hastighetskodning är dock omöjligt med yt-EMG. Vidare förlitar sig EMG på ämnets vilja att generera maximala sammandragningar, och denna nivå av samarbete är osannolikt i stora djurmodeller. Även om det kan vara informativt att bedöma förändringar i EMG under gångcykeln, representerar dessa data inte en maximal funktionell förmåga hos skelettmuskelgruppen av intresse. Ultraljudsbaserad avbildning som använder B-läge och skjuvvågselastografi är en annan icke-invasiv modalitet som används för att utvärdera muskelfunktionen. Det finns ett bra samband mellan Youngs modul mätt med elastografi och ökande muskelbelastning39,40. Skjuvvågselastografi har validerats och använts som ett kvantitativt mått på passiv vävnadsstyvhet 41,42,43,44,45, inklusive i en svinvolymetrisk muskelförlustskada modell23. Det kan också användas som en indirekt mätning av aktiv muskelkraft produktion39. Begränsningar som liknar EMG för ämnesvilja och samarbete för att utföra sammandragningar finns dock fortfarande.
In vivo-protokollet som beskrivs här, i motsats till löpbandsavstånd och EMG, ger en pålitlig, reproducerbar och maximal bedömning av muskelfunktionen. Detta protokoll framkallar muskelsammandragningar på ett kontrollerat, kvantifierbart sätt som är oberoende av motivation. Specifikt används perkutana elektroder för att stimulera nervaxoner som kringgår centrala nervsystemet. Depolarisering av nervaxonerna engagerar alla motorenheter vilket eliminerar variationen i samband med rekrytering av motorenheter. Dessutom kontrollerar utredaren hastighetskodning (stimuleringsfrekvens). Den resulterande neuromuskulära fysiologin som gäller för detta tillvägagångssätt börjar med spänningsstyrd natriumkanalaktivering vid noderna i Ranvier. All efterföljande (eller nedströms) fysiologi är engagerad, inklusive excitation-kontraktionskoppling och cross-bridge-cykling. En betydande fördel med den icke-invasiva muskelanalysen in vivo är att kontraktil muskelfunktion kan mätas upprepade gånger, till exempel varje vecka, för att övervaka muskelstyrka efter skada, intervention eller över en sjukdomsprogression.
Metodens begränsningar
In vivo-utrustningen som beskrivs i detta protokoll tillåter passivt och aktivt isometriskt vridmoment som en funktion av ledvinkel och stimuleringsfrekvens. Den testapparat som används stöder inte mätning av dynamiska sammandragningar (t.ex. isokinetiska excentriska eller koncentriska sammandragningar). Apparaten tillåter ett rörelseområde på 105 ° för att karakterisera förhållandet mellan vridmoment och ledvinkel och använder en lastcell med ett maximalt vridmomentområde på ~ 50 N · m. Specifika experimentella frågor kan kräva prestandaegenskaper utanför dessa specifikationer. I synnerhet kan lastcellen på denna beskrivna apparat bytas ut mot större vridmomentområden om det behövs.
Protokollet som beskrivs häri för att mäta maximal neuromuskulär styrka in vivo har anmärkningsvärda begränsningar. För det första kräver denna metod anestesi, som kan utföras annorlunda per djuranläggningsprotokoll och resurser. Anestetika är kända för att ha varierande effekter på neuromuskulär funktion och har visat sig förändra musens in vivo dorsiflexormomentproduktion på ett bedövningsmedelstyp och -dosberoende sätt29. De olika effekterna av anestetika på det stora djurets in vivo-vridmoment är oklara; Därför måste kontroll- och experimentgrupper ha samma anestesimedel (t.ex. alla grupper som administreras ketamin) för att kontrollera denna variation. För det andra begränsar beroendet av diffusionsmönster in vivo utforskning av cellulära mekanismer för kontraktil dysfunktion och akuta läkemedelstoxiciteter. Till exempel kan koffein användas under in vitro-organbadtestning av en isolerad muskel för att stimulera sarkoplasmatisk retikulumkalciumfrisättning, kringgå excitation-kontraktionskoppling46 direkt. Mängden koffein för att inducera denna effekt (mM) är dödlig i en in vivo-inställning . Läkemedelspåverkan på hela kroppen (t.ex. njur-/leverstress) och efterföljande faktorer som utsöndras i omlopp måste övervägas om detta tillvägagångssätt används för läkemedelsscreening på akut muskelstyrka23. För det tredje avviker användningen av maximal elektrisk nervstimulering från frivilliga rekryteringsstrategier, som diskuterats ovan, och återspeglar därför inte förändringar i styrka som kan bero på neuromuskulära rekryteringsanpassningar.
Momentmätningar in vivo kan också begränsas när det gäller att fastställa en särskild mekanism för experimentella observationer. Till exempel beror vridmomentet om fotleden inte bara på muskelkraftsproduktion utan också på sen- och led- och bindvävsegenskaperna. Dessutom genereras kraft av grupper av muskler, speciellt plantarböjarna (gastrocnemius, soleus och plantaris muskler) och dorsiflexorerna (peroneus tertius, tibialis och digitorum muskler) hos grisar. Därför kräver tolkningar av maximala in vivo-vridmomentdata hänsyn till potentiella muskulotendinösa och anatomiska förändringar och är begränsade till muskelgrupper, inte enskilda muskler. Relaterat består muskelgrupper ofta av en blandning av övervägande snabba och långsamma muskelfibrer, såsom gastrocnemius respektive soleus-muskeln hos plantarböjarna. Kontraktila egenskaper såsom sammandragningshastighet och avslappning (eller tid-till-topp-sammandragning och halvavslappningstid) är inte tillförlitliga indikatorer på fibertypfysiologi med användning av in vivo kontra isolerade muskelpreparat, såsom in vitro- eller in situ-testprotokoll 47. Isolerade muskelpreparat är också överlägsna när det gäller att förstå påverkan av biomekaniska parametrar på muskelfunktionen eftersom egenskaper som muskellängd kan kontrolleras exakt; det är viktigt att betona att förhållandet mellan ledvinkel och vridmoment inte är direkt ekvivalent med förhållandet mellan muskellängd och kraft, eftersom sen (t.ex. slack), muskel (t.ex. pennationsvinkel, sarkomer överlappning) och ledegenskaper (t.ex. momentarm) som bidrar till vridmomentproduktion är beroende av ledvinkeln. I detta syfte skulle funktionstestning av stora djur på plats48 kunna vara ett värdefullt komplement till in vivo-testning, med tanke på att in situ-testning är ett terminalt experiment. Andra framsteg till det nuvarande protokollet som kan utforskas i framtiden för att förbättra den mekanistiska insikten i experimentella fynd inkluderar att använda ultraljud B-lägesavbildning för att mäta muskel- och senarkitekturegenskaper och implantation av en senkraftgivare för att mäta muskelkraft under frivilliga och elektriskt stimulerade sammandragningar49.
Metodens betydelse och potentiella tillämpningar
Detta protokoll utvärderar in vivo vridmomentproducerande kapacitet hos svin dorsiflexormuskelgruppen, vilket visar en icke-invasiv metod för att bedöma vinst eller förlust av muskelfunktion i en fysiologisk miljö. Eftersom metoden är icke-terminal för grisen kan den också användas för att utvärdera muskelfunktionen hos samma försökspersoner longitudinellt under utvecklingen av en sjukdom, eller före, under och efter en behandlingsstrategi. Som sådan kan en upprepad statistisk design möjliggöra robusta statistiska jämförelser med större kraft och färre djur jämfört med oberoende åtgärder. Dessutom är skelettmuskeldysfunktion en framträdande komponent i olika sjukdomsprocesser och tillstånd, såsom kronisk sjukdomsassocierad muskelförtvining (t.ex. hjärtsvikt, njursvikt, AIDS, cancer, etc.), muskeldystrofi, neurodegenerativa sjukdomar (t.ex. SMA eller amyotrofisk lateralskleros; ALS), åldrande (dvs sarkopeni) och läkemedelstoxiciteter. Skelettmuskulaturens funktionsförmåga är ett kritiskt primärt utfallsmått för interventioner som träning, näring och läkemedel och regenerativa medicinska terapier. Således kan protokollet som beskrivs häri för att på ett tillförlitligt sätt utvärdera svinmomentproduktionskapacitet in vivo användas i många studieapplikationer. Det kan vara avgörande för att förvärva omfattande djurdata för översättning av utvecklande terapier.
The authors have nothing to disclose.
Arbete och data som presenterades stöddes i stort sett av US Army Medical Research and Material Command to BTC och SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); och Institutionen för veteranfrågor, Veterans Health Administration, Office of Research and Development (I21 RX003188) till JAC och Dr. Luke Brewster. Författarna erkänner tacksamt USAISR Veterinary Service and Comparative Pathology Branches och UMN Advanced Preclinical Imaging Center för teknisk hjälp med att slutföra dessa studier.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |