JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

Published: August 10, 2021
doi:
10.3791/62928
,
1Department of Chemistry & Biochemistry,University of Toledo

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשיקום פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין בפרוטואוליפוזומים מוגדרים.

Abstract

כמרכז לזרחן חמצוני ורגולציה אפופטוטית, המיטוכונדריה ממלאת תפקיד חיוני בבריאות האדם. תפקוד מיטוכונדריאלי תקין תלוי במערכת בקרת איכות חזקה לשמירה על הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס). ירידות בפרוטוסטזיס מיטוכונדריאלי נקשרו לסרטן, הזדקנות, ניוון עצבי, ומחלות רבות אחרות. Msp1 הוא ATPase AAA+ המעוגן בקרום המיטוכונדריאלי החיצוני השומר על פרוטאוסטזיס על ידי הסרת חלבונים מעוגנים בזנב. באמצעות רכיבים מטוהרים מחדש לתוך proteoliposomes, הראינו כי Msp1 הוא הכרחי מספיק כדי לחלץ חלבון מעוגן זנב מודל מן bilayer השומנים. המערכת המחודשת הפשוטה שלנו מתגברת על כמה מהמחסומים הטכניים שהפריעו למחקר מפורט של מיצוי חלבון ממברנה. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות ליצירת ליפוזומים, שחזור חלבון ממברנה, ובחאיית החילוץ Msp1.

Introduction

תפקוד תאי תקין תלוי בתהליך הנקרא פרוטאוסטזיס, המבטיח כי חלבונים פונקציונליים נמצאים בריכוז הנכון ובמיקום התאי1. כשלים בפרוטאוסטזיס מובילים לתפקוד אברונים נפגעים והם קשורים למחלות ניווניות רבות2,3,4. חלבוני ממברנה מציגים אתגרים ייחודיים לרשת הפרוטאוסטזיס מכיוון שהם חייבים להיות ממוקדים לממברנה הנכונה תוך הימנעות מצבירה מתחומי הטרנס-מברן ההידרופוביים (TMDs)5. כתוצאה מכך, מכונות מיוחדות התפתחו כדי להגן על TMD הידרופובי מן cytosol ולהקל על מיקוד והכנסת לתוך הממברנה התאית הנכונה6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

המיטוכונדריה הם הרכזת המטבולית של התא והם מעורבים בתהליכים תאיים חיוניים רבים כגון: זרחן חמצוני, ייצור אשכול גופרית ברזל, ורגולציה אפופטוטית16,17. אברונים אנדוזימביוטיים אלה מכילים שתי ממברנות, המכונות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית (IMM) והממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית (OMM). מעל 99% מתוך 1,500 חלבונים מיטוכונדריאליים אנושיים מקודדים בגנום הגרעיני ויש להעבירם על פני ממברנה אחת או שתיים שונות18,19. תפקוד מיטוכונדריאלי תקין ולכן תלוי ברשת פרוטאוסטזיס חזקה כדי לתקן שגיאות כלשהן פילוח חלבון או translocation.

המעבדה שלנו מתמקדת בתת-קבוצה של חלבונים ממברנה מיטוכונדריאלית הנקראים חלבונים מעוגנים בזנב (TA), שיש להם תחום טרנס-מברן יחיד בטרמינל C20,21,22,23,24. חלבוני ת”א מעורבים במספר תהליכים חיוניים, כגון אפופטוזיס, הובלת ארסיה, וטרנסלוקציה של חלבונים25. הטופולוגיה הייחודית של חלבוני ת”א דורשת החדרה לאחר התרגום, המתרחשת ברטיקולום אנדופלסמי (ER) על ידי הכניסה המודרכת של זנב מעוגן (GET) או רטיולמוסית קרום חלבון קומפלקס (EMC) או לתוך OMM על ידי מסלול מאופיין בצורה גרועה20,26,27,28. המאפיינים הביופיזיים של TMD נחוצים ומספיקים כדי להנחות חלבוני ת”א לממברנה הנכונה29. ההכרה במאפיינים ביופיסיים ולא במוטיב רצף מוגדר מגבילה את הנאמנות של מסלולי הפילוח5. לכן, הקצאה שגויה של חלבוני ת”א היא מתח נפוץ עבור רשתות פרוטאוסטזיס. מתח תאי, כגון עיכוב של מסלול GET, גורם לעלייה באילוץ חלבונים ל- OMM ולתפקוד מיטוכונדריאלי אלא אם כן חלבונים אלה מוסרים מייד30,31.

נושא נפוץ בפרוטוסטזיס ממברנה הוא השימוש ב- AAA+(TPase Aהמנוקד לחלבונים Activities תאיים) להסרת חלבונים ישנים, פגומים או לא מאוטצים מהלבייה השומנים1,32,33,34,35,36,37,38 . חלבוני AAA+ הם מנועים מולקולריים היוצרים טבעות הקסמריות ועוברים תנועות תלויות ATP כדי לשפץ מצע, לעתים קרובות על ידי טרנסלוקציה באמצעות נקבובית צירית צרה39,40. למרות מאמץ רב הוקדש לחקר החילוץ של חלבוני ממברנה על ידי AAA + ATPases, reconses הם מורכבים או כרוכים תערובת של שומנים וחומרי ניקוי41,42, אשר מגביל את הכוח הניסיוני לבחון את המנגנון של מיצוי מצע מן bilayer השומנים.

Msp1 הוא AAA + ATPase שמור מאוד המעוגן ב- OMM וב- peroxisomes הממלא תפקיד קריטי בפרוטוסטזיס של הממברנה על ידי הסרת חלבוני ת”א לא מאותרים43,44,45,46,47. Msp1 הוכח לאחרונה גם כדי להקל על לחץ ייבוא חלבון מיטוכונדריאלי על ידי הסרת חלבונים ממברנה לעכב במהלך טרנסלוקציה על פני OMM48. אובדן Msp1 או ההומולוגיה האנושית ATAD1 גורם לפיצול מיטוכונדריאלי, כשלים בזרחן חמצוני, התקפים, פציעה מוגברת בעקבות שבץ, ומוות מוקדם31,49,50,51,52,53,54,55,56.

הראינו כי ניתן לשחזר חלבוני ת”א עם Msp1 ולזהות את החילוץ מ bilayer השומנים57. מערכת פשוטה זו משתמשת בחלבונים מטוהרים לחלוטין המחודשים לליפוזומים מוגדרים המחקים את ה- OMM (איור 1)58,59. רמה זו של שליטה ניסיונית יכולה לענות על שאלות מכניות מפורטות של מיצוי מצע כי הם עקשניים מבחינה ניסיונית עם שחזורים מורכבים יותר מעורבים חלבונים אחרים AAA + . כאן, אנו מספקים פרוטוקולים ניסיוניים המפרטים את השיטות שלנו להכנת ליפוזום, שחזור חלבון ממברנה, ובחאיית החילוץ. תקוותנו היא כי פרטים ניסיוניים אלה יאפשרו מחקר נוסף של תהליך חיוני אך לא מובן היטב של פרוטאוסטזיס ממברנה.

Protocol

1. הכנת ליפוזום שלב מלאי כלורופורם של שומנים ביחסים מתאימים כדי לחקות את הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית. הכן 25 מ”ג של תערובת שומנים. אנו משתמשים בתערובת שהוקמה בעבר של שומנים המחקים ממברנות מיטוכונדריאליות, מורכב 48:28:10:10:4 יחס טוחנת של ביצת עוף פוספטידיל כולין (PC), ביצת עוף פוספטי…

Representative Results

כדי לפרש כראוי את התוצאות, יש לראות יחד את הג’ל נטול הכתם ואת הכתם המערבי. הג’ל ללא כתמים מבטיח טעינה שווה בכל הדגימות. בעת צפייה בג’ל ללא כתמים, המלווים (GST-calmodulin ו- GST-SGTA) יהיו גלויים בנתיבי קלט (I) ו- ELUTE (E). בדוק שוב כי עוצמת הרצועות האלה אחידה על פני כל דגימות הקלט. כמו כן, ודא כי העוצמה אחידה על פ…

Discussion

תפקוד מיטוכונדריאלי תקין תלוי במערכת בקרת איכות חלבון חזקה. בשל מגבלות מובנות בנאמנות של מסלולי פילוח חלבון ת”א, חלבוני ת”א מאושפזים הם מקור מתמיד ללחץ למיטוכונדריה. מרכיב מרכזי ברשת הפרוטאוסטזיס המיטוכונדריאלי הוא Msp1, שהוא ATPase מעוגן AAA+ המודרת שמסיר חלבוני ת”א לא מאוסים מה- OMM. כאן, תיארנו כ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MLW פיתח חלק מפרוטוקול זה במהלך לימודי הפוסט דוקטורט שלו עם ד”ר רוברט קינן באוניברסיטת שיקגו.

עבודה זו ממומנת על ידי מענק NIH 1R35GM137904-01 ל- MLW.

Materials

Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
  2. Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
  3. Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
  4. McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, (2020).
  5. Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
  6. Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
  7. Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
  8. Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
  9. Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
  10. Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, 88-91 (2016).
  11. Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, 770-785 (2018).
  12. Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, 1152-1155 (2015).
  13. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
  14. Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
  15. Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
  16. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
  17. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
  18. Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
  19. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
  20. Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
  21. Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
  22. Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
  23. Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
  24. Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
  25. Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, 1687-1694 (2007).
  26. Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
  27. McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
  28. Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, 3099 (2017).
  29. Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
  30. Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
  31. Chen, Y. -. C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
  32. Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
  33. Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
  34. van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
  35. Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
  36. Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
  37. Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
  38. Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
  39. Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
  40. Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
  41. Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
  42. Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
  43. Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
  44. Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
  45. Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
  46. Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
  47. Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
  48. Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR – a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, (2018).
  49. Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
  50. Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
  51. Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
  52. Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
  53. Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
  54. Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
  55. Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
  56. Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
  57. Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
  58. Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  59. Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).

Tags

Msp1AAA-ATPaseProtein Quality ControlReconstitutionLipid BilayerTA ProteinsLiposomesBioBeadsGlutathione Spin ColumnsExtraction AssaySDS-PAGE
check_url/62928?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image