JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

Published: August 10, 2021
doi:
10.3791/62928
,
1Department of Chemistry & Biochemistry,University of Toledo

Summary

Burada, tanımlanmış proteolipozomlarda tamamen saflaştırılmış bileşenlerle Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden uzlaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Oksidatif fosforilasyon ve apoptotik regülasyon merkezi olarak mitokondri insan sağlığında hayati bir rol oynar. Uygun mitokondriyal fonksiyon, protein homeostazının (proteostaz) korunması için sağlam bir kalite kontrol sistemine bağlıdır. Mitokondriyal proteostazdaki düşüşler kanser, yaşlanma, nörodejenerasyon ve diğer birçok hastalıkla bağlantılıdır. Msp1, yanlış hesaplanmış kuyruk bağlantılı proteinleri çıkararak proteostaz koruyan dış mitokondriyal membrana tutturulmuş bir AAA+ ATPazdır. Proteolipozomlara yeniden inşa edilen saflaştırılmış bileşenleri kullanarak, Msp1’in bir lipid bilayerden model kuyruk bağlantılı bir protein çıkarmak için gerekli ve yeterli olduğunu gösterdik. Basitleştirilmiş yeniden inşa edilmiş sistemimiz, membran protein ekstraksiyonunun ayrıntılı çalışmasını engelleyen teknik engellerin birkaçını aşıyor. Burada lipozomların üretimi, membran proteini rekonsupsiyonu ve MSP1 ekstraksiyon tahlilleri için detaylı yöntemler sunuyoruz.

Introduction

Doğru hücresel fonksiyon, fonksiyonel proteinlerin doğru konsantrasyonda ve hücresel konumda olmasını sağlayan proteostaz adı verilen bir işleme bağlıdır1. Proteostazdaki başarısızlıklar organel fonksiyonlarının tehlikeye atmasına yol açar ve birçok nörodejeneratifhastalıklailişkilidir 2,3,4. Membran proteinleri, hidrofobik transmembran etki alanlarından (TMD’ler) toplanmaktan kaçınırken doğru zara hedeflenmeleri gerektiğinden proteostaz ağına benzersiz zorluklar sunar5. Sonuç olarak, özel makine hidrofobik TMD’yi sitozodan korumak ve uygun hücresel membran 6 , 7 , 8,9, 10,11,12,13,14,15’ehedeflemeyi ve yerleştirmeyi kolaylaştırmak için evrimleşmiştir.

Mitokondri hücrenin metabolik merkezidir ve oksidatif fosforilasyon, demir-kükürt kümesi üretimi ve apoptotik düzenleme16,17gibi çok sayıda temel hücresel işlemde yer almaktadır. Bu endosimbiyotik organeller, iç mitokondriyal membran (İbb) ve dış mitokondriyal membran (OMM) olarak adlandırılan iki membran içerir. 1.500 insan mitokondriyal proteininin %99’undan fazlası nükleer genomda kodlanmıştır ve bir veya iki farklı zarda yer değiştirmeleri gerekir18,19. Bu nedenle uygun mitokondriyal fonksiyon, protein hedefleme veya translokasyondaki hataları düzeltmek için sağlam bir proteostaz ağına bağlıdır.

Laboratuvarımız, çok C-terminus 20,21,22,23,24’tetek bir transmembranetki alanına sahip kuyruk bağlantılı (TA) proteinleri adı verilen mitokondriyal membran proteinlerinin bir alt kümesine odaklanmaktadır. TA proteinleri, apoptoz, vezikül taşınması ve protein translokasyonu25gibi bir dizi temel işlemde yer almaktadır. TA proteinlerinin benzersiz topolojisi, endoplazmik retikulumda (ER) Kuyruk bağlantılı (GET) veya Endoplazmik retikül Membran protein Kompleksi (EMC) yollarının Rehberli Girişi ile veya kötü karakterize edilmiş bir yol olan 20 , 26 ,27,28ile OMM’ye giren çeviri sonrası ekleme gerektirir. TMD’nin biyofiziksel özellikleri, TA proteinlerini doğru zara yönlendirmek için gerekli ve yeterlidir29. Tanımlanmış bir dizi motifi yerine biyofiziksel özelliklerin tanınması, hedefleme yollarının doğruluğunu sınırlar5. Bu nedenle, TA proteinlerinin yanlış hesaplanması proteostaz ağları için yaygın bir strestir. GET yolunun inhibisyonu gibi hücresel stres, bu proteinler derhal çıkarılmadığı sürece OMM’ye protein yanlış sapkalizasyonunda ve mitokondriyal disfonksiyonda artışa neden olur30,31.

Membran proteostazında ortak bir tema, lipid bilayer 1 , 32, 33 , 34 , 35 ,36,37,38’den eski, hasarlı veya yanlış tanımlanmış proteinleri çıkarmak için AAA+ (hücresel A eğilimleri ile ssociated bir TPase A)proteinlerinin kullanılmasıdır. . AAA+ proteinleri, altıgen halkalar oluşturan ve genellikle dar bir eksenel gözenek yoluyla translokasyon yoluyla bir substratı yeniden şekillendirmek için ATP bağımlı hareketlerinden geçen moleküler motorlardır39,40. AAA+ ATPases tarafından membran proteinlerinin ekstraksiyonunu incelemeye büyük çaba sarf edilmiş olsa da, rekonstrüzyonlar karmaşıktır veya lipid bilayerden substrat ekstraksiyon mekanizmasını incelemek için deneysel gücü sınırlayan lipit ve deterjan41,42karışımını içerir.

Msp1, OMM’ye bağlı yüksek oranda korunmuş bir AAA+ ATPaz ve yanlış tanımlanmış TA proteinleri43 , 44 , 45,46,47’yiçıkararak membran proteostazında kritik rol oynayan peroksiomlardır. Msp1’in ayrıca yakın zamanda OMM48’detranslokasyon sırasında duran membran proteinlerini çıkararak mitokondriyal protein ithalat stresini hafifletdiği gösterilmiştir. Msp1 veya insan homolog ATAD1 kaybı mitokondriyal parçalanma, oksidatif fosforilasyonda başarısızlıklar, nöbetler, inme sonrasında yaralanma artışı ve erken ölüm31,49,50 , 51,52,53,54,55,56ile sonuçlanır.

TA proteinlerini Msp1 ile birlikte yeniden inşa etmenin ve lipid bilayer57’denekstraksiyonu tespit etmenin mümkün olduğunu gösterdik. Bu basitleştirilmiş sistem, OMM’yi taklit eden tanımlanmış lipozomlara yeniden inşa edilmiş tamamen saflaştırılmış proteinler kullanır (Şekil 1)58,59. Bu deneysel kontrol seviyesi, diğer AAA+ proteinlerini içeren daha karmaşık rekonstrüzyonlarla deneysel olarak zor olan substrat ekstraksiyonunun ayrıntılı mekanistik sorularını ele alabilir. Burada, lipozom hazırlama, membran proteini rekonsupsiyonu ve ekstraksiyon tahlil yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklayan deneysel protokoller sunuyoruz. Bu deneysel detayların membran proteostazının temel ama iyi anlaşılmayan sürecinin daha fazla incelenmesini kolaylaştıracağını umuyoruz.

Protocol

1. Lipozom Hazırlığı Dış mitokondriyal zarı taklit etmek için lipitlerin kloroform stoklarını uygun oranlarda birleştirin. 25 mg lipit karışımı hazırlayın. Mitokondriyal membranları taklit eden daha önce kurulmuş bir lipit karışımı kullanıyoruz, 48:28:10:10:4 azı dişi tavuk yumurtası fosfatidyl kolin (PC), tavuk yumurtası fosfatidil etanolamin (PE), sığır karaciğer fosfatidil inositol (PI), sentetik 1,2-dioleoyl-s’den oluşur ve sentetik 1′,3′-bis[1,2-dioleoyl-sn-glisero…

Representative Results

Sonuçları düzgün bir şekilde yorumlamak için lekesiz jel ve batı lekesi birlikte görülmelidir. Lekesiz jel, tüm numunelerde eşit yükleme sağlar. Lekesiz jeli görüntülerken, refakatçiler (GST-calmodulin ve GST-SGTA) INPUT (I) ve ELUTE (E) şeritlerinde görülebilir. Bu bantların yoğunluğunun tüm INPUT örneklerinde tekdüze olup olmadığını iki kez kontrol edin. Aynı şekilde, yoğunluğun ELUTE numuneleri boyunca düzgün olduğundan emin olun. ELUTE, Gİrİş’ten 5 kat daha konsantredir ve bu y…

Discussion

Uygun mitokondriyal fonksiyon sağlam bir protein kalite kontrol sistemine bağlıdır. TA protein hedefleme yollarının doğruluğundaki doğal sınırlar nedeniyle, yanlış hesaplanan TA proteinleri mitokondri için sürekli bir stres kaynağıdır. Mitokondriyal proteostaz ağının önemli bir bileşeni, yanlış etiketlenmiş TA proteinlerini OMM’den uzaklaştıran bir membran bağlantılı AAA + ATPase olan Msp1’dir. Burada, proteolipozomların nasıl hazırlanacağını, Msp1 ve bir model TA proteinini nasıl ye…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MLW, chicago Üniversitesi’nde Dr. Robert Keenan ile yaptığı doktora sonrası çalışmalar sırasında bu protokolün bir parçasını geliştirdi.

Bu çalışma MLW’ye NIH hibe 1R35GM137904-01 tarafından finanse edilir.

Materials

Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
  2. Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
  3. Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
  4. McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, (2020).
  5. Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
  6. Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
  7. Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
  8. Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
  9. Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
  10. Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, 88-91 (2016).
  11. Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, 770-785 (2018).
  12. Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, 1152-1155 (2015).
  13. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
  14. Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
  15. Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
  16. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
  17. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
  18. Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
  19. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
  20. Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
  21. Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
  22. Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
  23. Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
  24. Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
  25. Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, 1687-1694 (2007).
  26. Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
  27. McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
  28. Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, 3099 (2017).
  29. Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
  30. Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
  31. Chen, Y. -. C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
  32. Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
  33. Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
  34. van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
  35. Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
  36. Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
  37. Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
  38. Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
  39. Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
  40. Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
  41. Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
  42. Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
  43. Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
  44. Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
  45. Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
  46. Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
  47. Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
  48. Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR – a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, (2018).
  49. Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
  50. Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
  51. Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
  52. Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
  53. Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
  54. Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
  55. Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
  56. Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
  57. Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
  58. Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  59. Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).

Tags

Msp1AAA-ATPaseProtein Quality ControlReconstitutionLipid BilayerTA ProteinsLiposomesBioBeadsGlutathione Spin ColumnsExtraction AssaySDS-PAGE
check_url/62928?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image