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Biochemistry

完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成

Published: August 10, 2021
doi:
10.3791/62928
,
1Department of Chemistry & Biochemistry,University of Toledo

Summary

ここでは、定義されたプロテオリポソームにおける完全に精製された成分を用いたMsp1抽出活性の再構成のための詳細なプロトコルを提示する。

Abstract

酸化リン酸化とアポトーシス調節の中心として、ミトコンドリアは人間の健康に重要な役割を果たします。適切なミトコンドリア機能は、タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)を維持するための堅牢な品質管理システムに依存します。ミトコンドリアプロテオスタシスの低下は、癌、老化、神経変性、および他の多くの疾患に関連している。Msp1は、ミトコンドリア外膜に固定されたAAA+ATPaseであり、誤局化したテールアンカータンパク質を除去することによってプロテオスタシスを維持します。精製した成分をプロテオリポソームに再構成し、Msp1が脂質二重層からモデルのテールアンカータンパク質を抽出するのに十分であることを示しました。当社の簡略化された再構成システムは、膜タンパク質抽出の詳細な研究を妨げている技術的障壁のいくつかを克服します。ここでは、リポソームの生成、膜タンパク質の再構成、Msp1抽出アッセイの詳細な方法を提供します。

Introduction

適切な細胞機能は、機能的タンパク質が正しい濃度と細胞位置1であることを保証するプロテオスタシスと呼ばれるプロセスに依存します。プロテオスタシスの障害は、オルガネラ機能の低下を招き、多くの神経変性疾患2、3、4に関連している。膜タンパク質は、疎水性膜貫通ドメイン(TM)5からの凝集を避けながら、正しい膜を標的としなければならないプロテオスタシスネットワークに固有の課題を提示する。その結果、特殊化された機械は、疎水性TMDをサイトゾルから保護し、適切な細胞膜6、7、8、9、10、11、12、13、14、15への標的化と挿入を容易にするために進化しました。

ミトコンドリアは細胞の代謝ハブであり、酸化リン酸化、鉄硫黄クラスター生成、アポトーシスレギュレーション16、17など、数多くの必須細胞プロセスに関与している。これらの子宮内生体オルガネラは、ミトコンドリア膜(IMM)および外ミトコンドリア膜(OMM)と呼ばれる2つの膜を含む。1,500個のヒトミトコンドリアタンパク質の99%以上が核ゲノムにコードされており、1つまたは2つの異なる膜18、19に渡ってトランスロケーションする必要がある。したがって、適切なミトコンドリア機能は、タンパク質ターゲティングまたは転座の誤差を修正するために、堅牢なプロテオスタシスネットワークに依存します。

私たちの研究室では、非常にC末に20、21、22、23、24の単一の膜貫通ドメインを有する、尾アンカー(TA)タンパク質と呼ばれるミトコンドリア膜タンパク質のサブセットに焦点を当てています。TAタンパク質は、アポトーシス、小胞輸送、およびタンパク質転座25などの多くの必須プロセスに関与している。TAタンパク質のユニークなトポロジーは、尾アンカー(GET)またはエンドパラムレチラム膜タンパク質複合体(EMC)経路によって導付入り(GET)によって小胞体(ER)で起こる、または十分に特徴付けの経路20、26、27、28によってOMMに起こる翻訳後挿入を必要とする。TMDの生物物理学的性質は、TAタンパク質を正しい膜29に導くために必要であり、十分である。定義された配列モチーフではなく生物物理学的特徴の認識は、標的経路5の忠実さを制限する。したがって、TAタンパク質の誤局在化は、プロテオスタシスネットワークに対する一般的なストレスである。細胞ストレスは、GET経路の阻害などの、これらのタンパク質が速やかに除去されない限りOMMおよびミトコンドリア機能障害に対するタンパク質の誤局在化の増加を引き起こす30,31。

膜プロテオスタシスの一般的なテーマは、AAA+ (細胞A ctivitiesでソシエ化されたTPase A)タンパク質を使用して、脂質二重層1、32、33、34、35、36、37、38から古い、損傷した、または誤局化したタンパク質を除去することです。 .AAA+タンパク質は、六方体環を形成し、基板を改造するためにATP依存的な動きを受ける分子モーターであり、しばしば狭い軸孔39、40を通して転位することによって。AAA+ATPasesによる膜タンパク質の抽出の研究には多大な努力が必要であったが、再構成は複雑であるか、脂質と洗剤41,42の混合物を含み、脂質二重層からの基質抽出のメカニズムを調べる実験力を制限する。

Msp1は、OMMおよびペルオキシソームに固定された高度に保存されたAAA+ATPaseであり、誤局化したTAタンパク質43、44、45、46、47を除去することによって膜プロテオスタシスにおいて重要な役割を果たす。Msp1は、OMM48を横断する転座の間に失速する膜タンパク質を除去することによって、ミトコンドリアタンパク質のインポートストレスを軽減することも最近示された。Msp1またはヒトホモログATAD1の喪失は、ミトコンドリア断片化、酸化リン酸化の障害、発作、脳卒中後の傷害の増加、および早期死亡31、49、50、51、52、53、54、55、56をもたらす。

我々は、TAタンパク質をMsp1と共再構成し、脂質二重層57からの抽出を検出することが可能であることを示した。この簡略化されたシステムは、完全に精製されたタンパク質を、OMM(図1)58、59を模倣する定義されたリポソームに再構成して使用する。このレベルの実験的制御は、他のAAA+タンパク質を含むより複雑な再構成で実験的に難解な基質抽出の詳細な機械学的な質問に対処することができます。ここでは、リポソーム調製法、膜タンパク質再構成法、抽出アッセイの方法を詳述した実験的プロトコルを提供します。これらの実験の詳細が、膜プロテオスタシスの本質的だが十分に理解されていないプロセスのさらなる研究を促進することを期待しています。

Protocol

1. リポソーム製剤 適切な比率で脂質のクロロホルムストックを組み合わせて、外のミトコンドリア膜を模倣します。 脂質混合物の25mgを調製します。ミトコンドリア膜を模倣する脂質の既に確立された混合物を使用し、 鶏卵ホスファチジルコリン(PC)、鶏卵ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ウシ肝臓ホスファチジルイノシトール(PI)、合成1,2-ジオレオイルの48:28:10:10:4モル比?…

Representative Results

結果を正しく解釈するには、染色フリーゲルとウェスタンブロットを一緒に見る必要があります。染色フリーゲルは、すべてのサンプルで等しい負荷を保証します。染色フリーゲルを見ると、シャペロン(GST-カルモドゥリンおよびGST-SGTA)がINPUT(I)およびELUTE(E)レーンに表示されます。これらのバンドの強度がすべての INPUT サンプルで均一であることを再確認します。同様に、輝度が ELUTE サン?…

Discussion

適切なミトコンドリア機能は、堅牢なタンパク質の品質管理システムに依存します。TAタンパク質ターゲティング経路の忠実度に固有の限界のために、誤局化TAタンパク質はミトコンドリアのストレスの一定の源です。ミトコンドリアプロテオスタシスネットワークの重要な成分はMsp1であり、これはOMMから誤局的なTAタンパク質を除去する膜固定AAA+ATPaseである。ここでは、プロテオリポソー?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MLWは、シカゴ大学のロバート・キーナン博士との博士後期研究中に、このプロトコルの一部を開発しました。

この作業は、NIH助成金1R35GM137904-01 MLWに資金を提供しています。

Materials

Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017
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Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).
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