Rekonstituering av msp1-ekstraksjonsaktivitet med fullstendig rensede komponenter
Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for rekonstituering av Msp1 utvinning aktivitet med fullt rensede komponenter i definerte proteoliposomer.
Abstract
Som senter for oksidativ fosforylering og apoptotisk regulering spiller mitokondrier en viktig rolle i menneskers helse. Riktig mitokondriefunksjon avhenger av et robust kvalitetskontrollsystem for å opprettholde protein homeostase (proteostase). Nedgang i mitokondrieproteostase har vært knyttet til kreft, aldring, nevrodegenerasjon og mange andre sykdommer. Msp1 er en AAA+ ATPase forankret i den ytre mitokondriemembranen som opprettholder proteostase ved å fjerne feilaliserte hale-forankrede proteiner. Ved hjelp av rensede komponenter rekonstituert i proteoliposomer, har vi vist at Msp1 er nødvendig og tilstrekkelig til å trekke ut et modell hale-forankret protein fra en lipid bilayer. Vårt forenklede rekonstituerte system overvinner flere av de tekniske barrierene som har hindret detaljert studie av membranproteinutvinning. Her gir vi detaljerte metoder for generering av liposomer, membranproteinrekonstituering og Msp1-ekstraksjonsanalysen.
Introduction
Riktig cellulær funksjon avhenger av en prosess som kalles proteostase, som sikrer at funksjonelle proteiner er i riktig konsentrasjon og cellulær plassering1. Feil i proteostase fører til kompromittert organellefunksjon og er forbundet med mange nevrodegenerative sykdommer2,3,4. Membranproteiner gir unike utfordringer for proteostasenettverket, da de må målrettes mot riktig membran samtidig som de unngår aggregering fra de hydrofobe transmembrandomenene (TMDs)5. Følgelig har spesialiserte maskiner utviklet seg for å beskytte den hydrofobe TMD fra cytosolen og lette målretting og innsetting i riktig cellulær membran6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitokondrier er cellens metabolske nav og er involvert i mange viktige cellulære prosesser som: oksidativ fosforylering, jern-svovelklyngegenerering og apoptotisk regulering16,17. Disse endosymbiotiske organellene inneholder to membraner, referert til som den indre mitokondriemembranen (IMM) og den ytre mitokondriemembranen (OMM). Over 99% av de 1500 humane mitokondrieproteinene er kodet i atomgenomet og må omfordeles over en eller to forskjellige membraner18,19. Riktig mitokondriefunksjon avhenger derfor av et robust proteostasenettverk for å korrigere eventuelle feil i proteinmålretting eller translokasjon.
Laboratoriet vårt fokuserer på en undergruppe av mitokondriemembranproteiner kalt hale-forankrede (TA) proteiner, som har et enkelt transmembrandomene ved selve C-terminus20,21,22,23,24. TA-proteiner er involvert i en rekke essensielle prosesser, for eksempel apoptose, vesicle transport og proteintranslokasjon25. Den unike topologien til TA-proteiner krever post-translasjonell innsetting, som forekommer i endoplasmic retikulum (ER) ved guided entry of Tail-anchored (GET) eller Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) veier eller inn i OMM av en dårlig karakterisert sti20,26,27,28. De biofysiske egenskapene til TMD er nødvendige og tilstrekkelige til å lede TA-proteiner til riktigmembran 29. Anerkjennelsen av biofysiske egenskaper i stedet for et definert sekvensmotiv begrenser gjengivelsen av målrettingsveiene5. Dermed er feillokalisering av TA-proteiner et vanlig stress for proteostasenettverkene. Cellulært stress, som hemming av GET-banen, forårsaker en økning i protein feillokalisering til OMM og mitokondrie dysfunksjon med mindre disse proteinene fjernes raskt30,31.
Et vanlig tema i membranproteostase er bruken av AAA+ (ATPase Associated med cellulære Activities) proteiner for å fjerne gamle, skadede eller feillokaliserte proteiner fra lipidbilayeren1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA+ proteiner er molekylære motorer som danner heksameriske ringer og gjennomgår ATP-avhengige bevegelser for å ombygge et substrat, ofte ved omplassering gjennom en smal aksial pore39,40. Selv om det har vært lagt stor innsats for å studere utvinning av membranproteiner av AAA + ATPases, er rekonstitueringene komplekse eller involverer en blanding av lipider og vaskemiddel41,42, som begrenser den eksperimentelle kraften til å undersøke mekanismen for substratutvinning fra lipidbilayeren.
Msp1 er en høyt bevart AAA + ATPase forankret i OMM og peroksisomer som spiller en kritisk rolle i membranproteostase ved å fjerne feilaliserte TA-proteiner43,44,45,46,47. Msp1 ble også nylig vist å lindre mitokondrieproteinimportstress ved å fjerne membranproteiner som stopper under translokasjon over OMM48. Tap av Msp1 eller den menneskelige homologEN ATAD1 resulterer i mitokondriefragmentering, svikt i oksidativ fosforylering, anfall, økt skade etter hjerneslag og tidlig død31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Vi har vist at det er mulig å co-rekonstituere TA-proteiner med Msp1 og oppdage utvinningen fra lipidbilayeren57. Dette forenklede systemet bruker fullt rensede proteiner rekonstituert i definerte liposomer som etterligner OMM (figur 1)58,59. Dette nivået av eksperimentell kontroll kan adressere detaljerte mekanistiske spørsmål om substratutvinning som er eksperimentelt intractable med mer komplekse rekonstitueringer som involverer andre AAA + proteiner. Her tilbyr vi eksperimentelle protokoller som beskriver våre metoder for liposompreparat, membranproteinrekonstituering og ekstraksjonsanalysen. Det er vårt håp at disse eksperimentelle detaljene vil lette videre studier av den essensielle, men dårlig forståtte prosessen med membranproteostase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riktig mitokondriefunksjon avhenger av et robust proteinkvalitetskontrollsystem. På grunn av iboende grenser i gjengivelsen av TA-proteinmålrettingsveiene, er feillokaliserte TA-proteiner en konstant kilde til stress for mitokondrier. En nøkkelkomponent i mitokondrieproteostasenettverket er Msp1, som er en membran forankret AAA + ATPase som fjerner feillokaliserte TA-proteiner fra OMM. Her har vi beskrevet hvordan du lager proteoliposomer, korekonstituerer Msp1 og et modell TA-protein, og utfører en ekstraksjonsanaly…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MLW utviklet en del av denne protokollen under sine postdoktorstudier med Dr. Robert Keenan ved University of Chicago.
Dette arbeidet er finansiert av NIH grant 1R35GM137904-01 til MLW.
Materials
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
| Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
| Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
| Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
| Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |
References
- Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
- Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
- Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
- McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, (2020).
- Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
- Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
- Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
- Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
- Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
- Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, 88-91 (2016).
- Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, 770-785 (2018).
- Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, 1152-1155 (2015).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
- Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
- Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
- Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
- Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
- Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
- Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
- Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
- Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
- Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
- Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, 1687-1694 (2007).
- Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
- McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
- Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, 3099 (2017).
- Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
- Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
- Chen, Y. -. C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
- Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
- van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
- Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
- Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
- Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
- Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
- Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
- Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
- Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
- Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
- Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
- Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
- Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
- Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
- Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
- Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR – a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, (2018).
- Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
- Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
- Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
- Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
- Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
- Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
- Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
- Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
- Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
- Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).
