Her presenterer vi en detaljert protokoll for rekonstituering av Msp1 utvinning aktivitet med fullt rensede komponenter i definerte proteoliposomer.
Som senter for oksidativ fosforylering og apoptotisk regulering spiller mitokondrier en viktig rolle i menneskers helse. Riktig mitokondriefunksjon avhenger av et robust kvalitetskontrollsystem for å opprettholde protein homeostase (proteostase). Nedgang i mitokondrieproteostase har vært knyttet til kreft, aldring, nevrodegenerasjon og mange andre sykdommer. Msp1 er en AAA+ ATPase forankret i den ytre mitokondriemembranen som opprettholder proteostase ved å fjerne feilaliserte hale-forankrede proteiner. Ved hjelp av rensede komponenter rekonstituert i proteoliposomer, har vi vist at Msp1 er nødvendig og tilstrekkelig til å trekke ut et modell hale-forankret protein fra en lipid bilayer. Vårt forenklede rekonstituerte system overvinner flere av de tekniske barrierene som har hindret detaljert studie av membranproteinutvinning. Her gir vi detaljerte metoder for generering av liposomer, membranproteinrekonstituering og Msp1-ekstraksjonsanalysen.
Riktig cellulær funksjon avhenger av en prosess som kalles proteostase, som sikrer at funksjonelle proteiner er i riktig konsentrasjon og cellulær plassering1. Feil i proteostase fører til kompromittert organellefunksjon og er forbundet med mange nevrodegenerative sykdommer2,3,4. Membranproteiner gir unike utfordringer for proteostasenettverket, da de må målrettes mot riktig membran samtidig som de unngår aggregering fra de hydrofobe transmembrandomenene (TMDs)5. Følgelig har spesialiserte maskiner utviklet seg for å beskytte den hydrofobe TMD fra cytosolen og lette målretting og innsetting i riktig cellulær membran6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitokondrier er cellens metabolske nav og er involvert i mange viktige cellulære prosesser som: oksidativ fosforylering, jern-svovelklyngegenerering og apoptotisk regulering16,17. Disse endosymbiotiske organellene inneholder to membraner, referert til som den indre mitokondriemembranen (IMM) og den ytre mitokondriemembranen (OMM). Over 99% av de 1500 humane mitokondrieproteinene er kodet i atomgenomet og må omfordeles over en eller to forskjellige membraner18,19. Riktig mitokondriefunksjon avhenger derfor av et robust proteostasenettverk for å korrigere eventuelle feil i proteinmålretting eller translokasjon.
Laboratoriet vårt fokuserer på en undergruppe av mitokondriemembranproteiner kalt hale-forankrede (TA) proteiner, som har et enkelt transmembrandomene ved selve C-terminus20,21,22,23,24. TA-proteiner er involvert i en rekke essensielle prosesser, for eksempel apoptose, vesicle transport og proteintranslokasjon25. Den unike topologien til TA-proteiner krever post-translasjonell innsetting, som forekommer i endoplasmic retikulum (ER) ved guided entry of Tail-anchored (GET) eller Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) veier eller inn i OMM av en dårlig karakterisert sti20,26,27,28. De biofysiske egenskapene til TMD er nødvendige og tilstrekkelige til å lede TA-proteiner til riktigmembran 29. Anerkjennelsen av biofysiske egenskaper i stedet for et definert sekvensmotiv begrenser gjengivelsen av målrettingsveiene5. Dermed er feillokalisering av TA-proteiner et vanlig stress for proteostasenettverkene. Cellulært stress, som hemming av GET-banen, forårsaker en økning i protein feillokalisering til OMM og mitokondrie dysfunksjon med mindre disse proteinene fjernes raskt30,31.
Et vanlig tema i membranproteostase er bruken av AAA+ (ATPase Associated med cellulære Activities) proteiner for å fjerne gamle, skadede eller feillokaliserte proteiner fra lipidbilayeren1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA+ proteiner er molekylære motorer som danner heksameriske ringer og gjennomgår ATP-avhengige bevegelser for å ombygge et substrat, ofte ved omplassering gjennom en smal aksial pore39,40. Selv om det har vært lagt stor innsats for å studere utvinning av membranproteiner av AAA + ATPases, er rekonstitueringene komplekse eller involverer en blanding av lipider og vaskemiddel41,42, som begrenser den eksperimentelle kraften til å undersøke mekanismen for substratutvinning fra lipidbilayeren.
Msp1 er en høyt bevart AAA + ATPase forankret i OMM og peroksisomer som spiller en kritisk rolle i membranproteostase ved å fjerne feilaliserte TA-proteiner43,44,45,46,47. Msp1 ble også nylig vist å lindre mitokondrieproteinimportstress ved å fjerne membranproteiner som stopper under translokasjon over OMM48. Tap av Msp1 eller den menneskelige homologEN ATAD1 resulterer i mitokondriefragmentering, svikt i oksidativ fosforylering, anfall, økt skade etter hjerneslag og tidlig død31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Vi har vist at det er mulig å co-rekonstituere TA-proteiner med Msp1 og oppdage utvinningen fra lipidbilayeren57. Dette forenklede systemet bruker fullt rensede proteiner rekonstituert i definerte liposomer som etterligner OMM (figur 1)58,59. Dette nivået av eksperimentell kontroll kan adressere detaljerte mekanistiske spørsmål om substratutvinning som er eksperimentelt intractable med mer komplekse rekonstitueringer som involverer andre AAA + proteiner. Her tilbyr vi eksperimentelle protokoller som beskriver våre metoder for liposompreparat, membranproteinrekonstituering og ekstraksjonsanalysen. Det er vårt håp at disse eksperimentelle detaljene vil lette videre studier av den essensielle, men dårlig forståtte prosessen med membranproteostase.
Riktig mitokondriefunksjon avhenger av et robust proteinkvalitetskontrollsystem. På grunn av iboende grenser i gjengivelsen av TA-proteinmålrettingsveiene, er feillokaliserte TA-proteiner en konstant kilde til stress for mitokondrier. En nøkkelkomponent i mitokondrieproteostasenettverket er Msp1, som er en membran forankret AAA + ATPase som fjerner feillokaliserte TA-proteiner fra OMM. Her har vi beskrevet hvordan du lager proteoliposomer, korekonstituerer Msp1 og et modell TA-protein, og utfører en ekstraksjonsanaly…
The authors have nothing to disclose.
MLW utviklet en del av denne protokollen under sine postdoktorstudier med Dr. Robert Keenan ved University of Chicago.
Dette arbeidet er finansiert av NIH grant 1R35GM137904-01 til MLW.
Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
Filter supports | Avanti | 610014 | |
Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |