قمنا بتصميم وبناء مختبر متنقل لقياس معدلات التنفس في الميتوكوندريا المعزولة للحيوانات البرية التي تم التقاطها في المواقع الميدانية. هنا ، نصف تصميم وتجهيز مختبر الميتوكوندريا المتنقل وبروتوكولات المختبر المرتبطة به.
تعد طاقة الميتوكوندريا موضوعا مركزيا في الكيمياء الحيوية الحيوانية وعلم وظائف الأعضاء ، حيث يستخدم الباحثون تنفس الميتوكوندريا كمقياس للتحقيق في القدرة الأيضية. للحصول على مقاييس التنفس الميتوكوندريا ، يجب استخدام عينات بيولوجية جديدة ، ويجب إكمال الإجراء المختبري بأكمله في غضون 2 ساعة تقريبا. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى قطع متعددة من المعدات المتخصصة لإجراء هذه المقايسات المختبرية. وهذا يخلق تحديا لقياس تنفس الميتوكوندريا في أنسجة الحيوانات البرية التي تعيش بعيدا عن مختبرات علم وظائف الأعضاء حيث لا يمكن الحفاظ على الأنسجة الحية لفترة طويلة جدا بعد جمعها في الحقل. علاوة على ذلك ، فإن نقل الحيوانات الحية لمسافات طويلة يؤدي إلى الإجهاد ، والذي يمكن أن يغير طاقة الميتوكوندريا.
تقدم هذه المخطوطة MitoMobile بجامعة أوبورن (AU) ، وهو مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الذي يمكن نقله إلى الميدان واستخدامه في الموقع لقياس استقلاب الميتوكوندريا في الأنسجة التي تم جمعها من الحيوانات البرية. يتم تقديم السمات الأساسية للمختبر المتنقل والطرق خطوة بخطوة لقياس معدلات التنفس الميتوكوندريا المعزولة. بالإضافة إلى ذلك ، تؤكد البيانات المقدمة نجاح تجهيز مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل وإجراء قياسات تنفس الميتوكوندريا. تكمن حداثة المختبر المتنقل في القدرة على القيادة إلى الميدان وإجراء قياسات الميتوكوندريا على أنسجة الحيوانات التي تم التقاطها في الموقع.
حتى الآن ، اقتصرت الدراسات المصممة لقياس طاقة الميتوكوندريا على المختبر أو الحيوانات التي تم التقاطها بالقرب من مختبرات علم وظائف الأعضاء الراسخة ، مما منع العلماء من إجراء دراسات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الأنسجة التي تم جمعها من الحيوانات خلال أنشطة مثل الهجرة والغوص والسبات1،2،3،4،5،6. في حين نجح العديد من الباحثين في قياس معدلات الأيض القاعدية والذروة ونفقات الطاقة اليومية للحيوانات البرية 7,8 ، ظلت قدرة الباحثين على قياس أداء الميتوكوندريا محدودة (ولكن انظر1،4،9). ويرجع ذلك جزئيا إلى الحاجة إلى أنسجة جديدة لعزل الميتوكوندريا ومنشأة مختبرية لإجراء عمليات العزل في غضون حوالي 2 ساعة من الحصول على الأنسجة الطازجة. بمجرد عزل الميتوكوندريا ، يجب أيضا إكمال قياسات تنفس الميتوكوندريا في غضون ~ 1 ساعة.
عادة ما يتم إجراء معدلات تنفس الميتوكوندريا المعزولة عن طريق قياس تركيز الأكسجين في حاوية محكمة الغلق متصلة بقطب كلارك. تستند النظرية الكامنة وراء هذه الطريقة إلى الملاحظة الأساسية القائلة بأن الأكسجين هو آخر مستقبل إلكتروني لتنفس الميتوكوندريا أثناء الفسفرة التأكسدية. لذلك ، مع انخفاض تركيز الأكسجين أثناء التجربة ، يفترض أن إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) يحدث10. الأكسجين المستهلك هو وكيل ل ATP المنتج. يمكن للباحثين إنشاء ظروف تجريبية محددة باستخدام ركائز مختلفة وبدء التنفس المستحث بالأدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) (الحالة 3) عن طريق إضافة كميات محددة مسبقا من ADP إلى الغرفة. بعد فسفرة جزيء ADP الخارجي إلى جزيء ATP ، ينخفض معدل استهلاك الأكسجين ، ويتم الوصول إلى الحالة 4 ويمكن قياسها. علاوة على ذلك ، تسمح إضافة مثبطات محددة بالحصول على معلومات تتعلق بالتنفس المتسرب والتنفس غير المنفصل10. تحدد نسبة الحالة 3 إلى الحالة 4 نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) ، وهي مؤشر اقتران الميتوكوندريا الكلي10,11. تشير القيم المنخفضة ل RCR إلى خلل وظيفي عام في الميتوكوندريا ، بينما تشير قيم RCR الأعلى إلى مدى أكبر من اقتران الميتوكوندريا10.
كما ذكرنا سابقا ، يجب إكمال جمع المواد البيولوجية وعزل الميتوكوندريا وقياس معدلات التنفس في غضون 2 ساعة من الحصول على الأنسجة. لإنجاز هذه المهمة دون نقل الحيوانات لمسافات كبيرة إلى المختبرات القائمة ، تم بناء مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل ليتم نقله إلى المواقع الميدانية حيث يمكن جمع هذه البيانات. تم تحويل مركبة ترفيهية Jayco Redhawk 2018 إلى مختبر فسيولوجيا جزيئية متنقل وسميت جامعة أوبورن (AU) MitoMobile (الشكل 1A). تم اختيار مركبة ترفيهية بسبب الثلاجة المدمجة والفريزر وخزان تخزين المياه والسباكة والكهرباء التي تعمل ببطاريات 12 فولت ومولد الغاز وخزان البروبان ونظام التسوية الذاتية. علاوة على ذلك ، توفر السيارة الترفيهية القدرة على البقاء في المواقع النائية طوال الليل لجمع البيانات. لم يتم تغيير مقدمة السيارة وتوفر أماكن القيادة والنوم (الشكل 1 ب). تمت إزالة وسائل الراحة المثبتة مسبقا في غرفة النوم (السرير والتلفزيون والخزانة) في الجزء الخلفي من السيارة والموقد.
تم تركيب أرفف مصنوعة حسب الطلب من الفولاذ المقاوم للصدأ وسطح عمل كوارتز مخصص مدعوم بإطار من الألومنيوم 80/20 بدلا من وسائل الراحة في غرفة النوم والموقد (الشكل 1C). توفر مقاعد المختبر مساحة كافية لجمع البيانات (الشكل 1 د). وأخذ في الاعتبار استهلاك الطاقة لكل قطعة من المعدات (أي أجهزة الطرد المركزي المبردة، وغرف التنفس الميتوكوندريا، وأجهزة قراءة الألواح، والحواسيب، والمجانسات، والموازين، والمجمدات الفائقة المحمولة، وغيرها من لوازم المختبرات العامة). لدعم الجهد الكبير ومتطلبات التيار لأجهزة الطرد المركزي ، تمت ترقية النظام الكهربائي إلى معدات الطائرات. تم تحويل حجرة خارجية في الجزء الخلفي من السيارة إلى حجرة لتخزين النيتروجين السائل ، والتي تلبي إرشادات وزارة النقل الأمريكية لتخزين النيتروجين السائل ونقله. تم بناء وحدة التخزين هذه من الفولاذ المقاوم للصدأ ولها تهوية مناسبة لمنع أي غاز نيتروجين متمدد من التسرب إلى مقصورة الركاب في السيارة.
للتأكد من إمكانية استخدام المختبر المتنقل في دراسات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، تم عزل الميتوكوندريا ، وتم قياس معدلات تنفس الميتوكوندريا من الفئران المنزلية المشتقة من البرية (Mus musculus) العضلات الهيكلية الخلفية. نظرا لأن Mus musculus هو كائن نموذجي ، فإن معدلات تنفس الميتوكوندريا لهذا النوع راسخة12،13،14. على الرغم من أن الدراسات السابقة قد وثقت عزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي15،16،17 ، إلا أنه تم وصف لمحة موجزة عن الطرق المستخدمة في طرق مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقلة أدناه.
يمكن مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الباحثين من عزل الميتوكوندريا وقياس معدلات تنفس الميتوكوندريا في غضون 2 ساعة من جمع الأنسجة في المواقع الميدانية النائية. تشير النتائج المقدمة هنا إلى أن قياسات تنفس الميتوكوندريا التي أجريت في AU MitoMobile قابلة للمقارنة مع القياسات التي أجريت في ?…
The authors have nothing to disclose.
يعترف المؤلفون بمارك نيلمز وجون تينانت من قسم الهندسة الكهربائية وهندسة الحاسبات في كلية صموئيل جين للهندسة بجامعة أوبورن للمساعدة في التجهيز الهيكلي والكهربائي ل AU MitoMobile. بالإضافة إلى ذلك ، يقر المؤلفون بالتمويل لتجهيز AU MitoMobile والبحث من منحة الجوائز الرئاسية بجامعة أوبورن للبحوث متعددة التخصصات (PAIR).
1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
ADP | VWR | 97061-104 | |
ATP | VWR | 700009-070 | |
Bradford | VWR | 7065-020 | |
Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
EGTA | VWR | EM-4100 | |
Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
Glutamate | VWR | A12919 | |
Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
Malate | VWR | 97062-140 | |
Mannitol | VWR | 97061-052 | |
Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
MOPS | VWR | 80503-004 | |
Policeman | VWR | 470104-462 | |
Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
Succinate | VWR | 89230-086 | |
Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
Tris-HCl | VWR | 97061-258 |