Ontwikkeling van een mobiel laboratorium voor mitochondriale fysiologie voor het meten van mitochondriale energetica in het veld
Summary
We ontwierpen en bouwden een mobiel laboratorium om de ademhalingsfrequentie te meten in geïsoleerde mitochondriën van wilde dieren die op veldlocaties zijn gevangen. Hier beschrijven we het ontwerp en de inrichting van een mobiel mitochondriaal laboratorium en de bijbehorende laboratoriumprotocollen.
Abstract
Mitochondriale energetica is een centraal thema in de biochemie en fysiologie van dieren, waarbij onderzoekers mitochondriale ademhaling gebruiken als maatstaf om het metabolische vermogen te onderzoeken. Om de metingen van mitochondriale ademhaling te verkrijgen, moeten verse biologische monsters worden gebruikt en moet de volledige laboratoriumprocedure binnen ongeveer 2 uur worden voltooid. Bovendien zijn er meerdere gespecialiseerde apparaten nodig om deze laboratoriumtests uit te voeren. Dit vormt een uitdaging voor het meten van mitochondriale ademhaling in de weefsels van wilde dieren die ver van fysiologische laboratoria leven, aangezien levend weefsel niet lang na verzameling in het veld kan worden bewaard. Bovendien veroorzaakt het vervoeren van levende dieren over lange afstanden stress, wat de mitochondriale energetica kan veranderen.
Dit manuscript introduceert de Auburn University (AU) MitoMobile, een mobiel mitochondriaal fysiologielaboratorium dat in het veld kan worden meegenomen en ter plaatse kan worden gebruikt om het mitochondriale metabolisme te meten in weefsels die zijn verzameld van wilde dieren. De basiskenmerken van het mobiele laboratorium en de stapsgewijze methoden voor het meten van geïsoleerde mitochondriale ademhalingsfrequenties worden gepresenteerd. Bovendien valideren de gepresenteerde gegevens het succes van het uitrusten van het mobiele mitochondriale fysiologielaboratorium en het uitvoeren van mitochondriale ademhalingsmetingen. De nieuwigheid van het mobiele laboratorium ligt in de mogelijkheid om naar het veld te rijden en mitochondriale metingen uit te voeren op de weefsels van dieren die ter plaatse zijn gevangen.
Introduction
Tot op heden zijn studies die zijn ontworpen om mitochondriale energetica te meten beperkt tot proefdieren of dieren die zijn gevangen in de buurt van gevestigde fysiologische laboratoria, waardoor wetenschappers geen mitochondriale bio-energetische studies kunnen uitvoeren in weefsels die zijn verzameld van dieren tijdens activiteiten zoals migratie, duiken en winterslaap 1,2,3,4,5,6 . Hoewel veel onderzoekers met succes de basale en piekstofwisseling en het dagelijkse energieverbruik van wilde dieren hebben gemeten 7,8, is het vermogen van onderzoekers om de prestaties van mitochondriën te meten beperkt gebleven (maar zie 1,4,9). Dit is deels te wijten aan de behoefte aan vers weefsel voor het isoleren van mitochondriën en een laboratoriumfaciliteit om de isolaties binnen ongeveer 2 uur na het verkrijgen van het verse weefsel uit te voeren. Zodra de mitochondriën zijn geïsoleerd, moeten ook de mitochondriale ademhalingsmetingen binnen ~1 uur worden voltooid.
Geïsoleerde mitochondriale ademhalingsfrequenties worden meestal uitgevoerd door de zuurstofconcentratie te meten in een afgesloten container die is aangesloten op een Clark-elektrode. De theorie achter deze methode is gebaseerd op de basisobservatie dat zuurstof de laatste elektronenacceptor is van mitochondriale ademhaling tijdens oxidatieve fosforylering. Daarom wordt aangenomen dat de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) plaatsvindt als de zuurstofconcentratie tijdens een experiment daalt10. Verbruikte zuurstof is een proxy voor geproduceerde ATP. Onderzoekers kunnen specifieke experimentele omstandigheden creëren met behulp van verschillende substraten en adenosinedifosfaat (ADP)-gestimuleerde ademhaling initiëren (toestand 3) door vooraf bepaalde hoeveelheden ADP aan de kamer toe te voegen. Na de fosforylering van het exogene ADP tot ATP neemt het zuurstofverbruik af en wordt toestand 4 bereikt en kan worden gemeten. Bovendien maakt de toevoeging van specifieke remmers het mogelijk om informatie te verkrijgen over lekademhaling en ontkoppelde ademhaling10. De verhouding tussen toestand 3 en toestand 4 bepaalt de respiratoire controleratio (RCR), de indicator van de algehele mitochondriale koppeling10,11. Lagere RCR-waarden duiden op algehele mitochondriale disfunctie, terwijl hogere RCR-waarden een grotere mate van mitochondriale koppeling10 suggereren.
Zoals eerder vermeld, moeten het verzamelen van biologisch materiaal, mitochondriale isolatie en het meten van de ademhalingsfrequentie binnen 2 uur na het verkrijgen van weefsel worden voltooid. Om deze taak uit te voeren zonder dieren over grote afstanden naar gevestigde laboratoria te vervoeren, werd een mobiel mitochondriaal fysiologielaboratorium gebouwd dat naar veldlocaties kan worden gebracht waar deze gegevens kunnen worden verzameld. Een Jayco Redhawk-recreatievoertuig uit 2018 werd omgebouwd tot een mobiel moleculair fysiologielaboratorium en kreeg de naam Auburn University (AU) MitoMobile (Figuur 1A). Er werd gekozen voor een recreatievoertuig vanwege de ingebouwde koelkast, vriezer, wateropslagtank en sanitair, elektriciteit aangedreven door 12-volt batterijen, gasgenerator, propaantank en zelfnivellerend systeem. Verder biedt het recreatievoertuig de mogelijkheid om op afgelegen locaties te overnachten voor het verzamelen van gegevens. De voorkant van het voertuig is niet gewijzigd en biedt de rij- en slaapvertrekken (figuur 1B). Eerder geïnstalleerde slaapkamervoorzieningen (bed, tv en kast) aan de achterkant van het voertuig en de kookplaat werden verwijderd.
Op maat gemaakte roestvrijstalen rekken en een op maat gemaakt aanrechtblad van kwarts, ondersteund door een 80/20 aluminium frame, werden geïnstalleerd in plaats van de slaapkamervoorzieningen en de kookplaat (Figuur 1C). De laboratoriumbanken bieden voldoende ruimte voor het verzamelen van gegevens (figuur 1D). Er werd rekening gehouden met het stroomverbruik van elk apparaat (d.w.z. gekoelde centrifuge, mitochondriale ademhalingskamers, plaatlezers, computers, homogenisatoren, weegschalen, draagbare ultravriezers en andere algemene laboratoriumbenodigdheden). Om de grote spannings- en stroomvraag van de centrifuge te ondersteunen, werd het elektrische systeem geüpgraded naar dat van apparatuur van vliegtuigkwaliteit. Een extern compartiment aan de achterkant van het voertuig werd omgebouwd tot een opslagplaats voor vloeibare stikstof, die voldoet aan de richtlijnen van het Amerikaanse ministerie van Transport voor de opslag en het transport van vloeibare stikstof. Deze opbergunit is gemaakt van roestvrij staal en heeft een goede ventilatie om te voorkomen dat uitzettend stikstofgas in het passagierscompartiment van het voertuig lekt.
Om te bevestigen dat het mobiele laboratorium kan worden gebruikt in mitochondriale bio-energetische studies, werden mitochondriën geïsoleerd en werden de mitochondriale ademhalingsfrequenties van in het wild afgeleide huismuizen (Mus musculus) skeletspieren van de achterpoten gemeten. Omdat Mus musculus een modelorganisme is, zijn de mitochondriale ademhalingsfrequenties van deze soort goed vastgesteld12,13,14. Hoewel eerdere studies mitochondriale isolatie via differentiële centrifugatie 15,16,17 hebben gedocumenteerd, wordt hieronder een kort overzicht gegeven van de methoden die worden gebruikt in de mobiele mitochondriale fysiologische laboratoriummethoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het mobiele laboratorium voor mitochondriale fysiologie stelt onderzoekers in staat om mitochondriën te isoleren en mitochondriale ademhalingsfrequenties te meten binnen 2 uur na weefselverzameling op afgelegen veldlocaties. De hierin gepresenteerde resultaten suggereren dat metingen van mitochondriale ademhaling in de AU MitoMobile vergelijkbaar zijn met metingen in een universitair onderzoekslaboratorium. In het bijzonder zijn de hier gepresenteerde waarden voor toestand 3, toestand 4 en RCR voor in het wild afgeleide…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Mark Nelms en John Tennant van de afdeling Electrical and Computer Engineering van het Samuel Ginn College of Engineering aan de Auburn University voor hun hulp bij de structurele en elektrische uitrusting van de AU MitoMobile. Bovendien erkennen de auteurs de financiering om de AU MitoMobile uit te rusten en onderzoek te doen van een Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR) -beurs.
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
