현장에서 미토콘드리아 에너지를 측정하기 위한 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실 개발
Summary
우리는 현장에서 포획한 야생 동물의 고립된 미토콘드리아에서 호흡수를 측정하기 위해 이동식 실험실을 설계하고 건설했습니다. 여기에서는 이동식 미토콘드리아 실험실의 설계 및 의장과 관련 실험실 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
미토콘드리아 에너지학은 동물 생화학 및 생리학의 중심 주제이며, 연구자들은 미토콘드리아 호흡을 대사 능력을 조사하기 위한 지표로 사용합니다. 미토콘드리아 호흡 측정값을 얻으려면 신선한 생물학적 샘플을 사용해야 하며 전체 실험실 절차는 약 2시간 이내에 완료되어야 합니다. 또한 이러한 실험실 분석을 수행하려면 여러 특수 장비가 필요합니다. 이로 인해 생리학 실험실에서 멀리 떨어진 야생 동물의 조직에서 미토콘드리아 호흡을 측정하는 데 어려움이 있는데, 이는 살아있는 조직이 현장에서 수집된 후 오랫동안 보존될 수 없기 때문입니다. 또한 살아있는 동물을 장거리로 운송하는 것은 스트레스를 유발하여 미토콘드리아 에너지를 변화시킬 수 있습니다.
이 원고는 야생 동물에서 채취한 조직의 미토콘드리아 대사를 측정하기 위해 현장에서 사용할 수 있는 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실인 Auburn University(AU)의 MitoMobile을 소개합니다. 이동식 실험실의 기본 기능과 격리된 미토콘드리아 호흡수를 측정하기 위한 단계별 방법이 제시됩니다. 또한 제시된 데이터는 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실을 갖추고 미토콘드리아 호흡 측정을 수행하는 것이 성공적이었음을 입증합니다. 이동식 실험실의 참신함은 현장으로 운전하여 현장에서 포획한 동물의 조직에 대한 미토콘드리아 측정을 수행할 수 있는 능력에 있습니다.
Introduction
현재까지 미토콘드리아 에너지를 측정하기 위해 고안된 연구는 실험실 동물 또는 기존 생리학 실험실 근처에서 포획한 동물로 제한되어 과학자들이 이동, 잠수 및 동면과 같은 활동 중에 동물로부터 수집한 조직에서 미토콘드리아 생체 에너지 연구를 수행하는 것을 배제했습니다 1,2,3,4,5,6 . 많은 연구자들이 야생동물의 기초 및 최대 대사율과 일일 에너지 소비량을 성공적으로 측정했지만(7,8), 미토콘드리아의 성능을 측정하는 연구자들의 능력은 여전히 제한되어 있다(1,4,9 참조). 이는 부분적으로 미토콘드리아를 분리하기 위한 신선한 조직과 신선한 조직을 얻은 후 약 2시간 이내에 분리를 수행하기 위한 실험실 시설이 필요하기 때문입니다. 미토콘드리아가 분리되면 미토콘드리아 호흡 측정도 ~1시간 이내에 완료되어야 합니다.
분리된 미토콘드리아 호흡수는 일반적으로 Clark 전극에 연결된 밀폐된 용기에서 산소 농도를 측정하여 수행됩니다. 이 방법의 이면에 있는 이론은 산소가 산화적 인산화 동안 미토콘드리아 호흡의 마지막 전자 수용체라는 기본 관찰에 기반을 두고 있습니다. 따라서, 실험 중에 산소 농도가 떨어지면, 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)의 생성이 발생한다고 가정한다10. 소비된 산소는 생성된 ATP의 대용물입니다. 연구원들은 다양한 기질을 사용하여 특정 실험 조건을 만들고 챔버에 미리 결정된 양의 ADP를 추가하여 아데노신 이인산(ADP) 자극 호흡(상태 3)을 시작할 수 있습니다. 외인성 ADP를 ATP로 인산화한 후, 산소 소비율은 감소하고, 상태 4에 도달하여 측정할 수 있다. 또한, 특이적 억제제의 첨가는 누출 호흡 및 비결합 호흡에 관한 정보를 얻을 수 있게 한다10. 상태 3과 상태 4의 비율은 전체 미토콘드리아 커플링10,11의 지표인 호흡 조절 비율(RCR)을 결정합니다. RCR 값이 낮을수록 전반적인 미토콘드리아 기능 장애를 나타내고, RCR 값이 높을수록 미토콘드리아 결합의 범위가 더 넓다는 것을 나타낸다10.
앞서 언급했듯이 생물학적 물질 수집, 미토콘드리아 분리 및 호흡수 측정은 조직 획득 후 2시간 이내에 완료되어야 합니다. 동물을 기존 실험실로 먼 거리로 운송하지 않고 이 작업을 수행하기 위해 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실을 건설하여 이러한 데이터를 수집할 수 있는 현장 위치로 가져갔습니다. 2018년형 Jayco Redhawk 레저용 차량은 이동식 분자 생리학 실험실로 개조되어 Auburn University(AU) MitoMobile로 명명되었습니다 (그림 1A). 빌트인 냉장고, 냉동고, 물 저장 탱크 및 배관, 12볼트 배터리로 구동되는 전기, 가스 발생기, 프로판 탱크 및 셀프 레벨링 시스템 때문에 레저용 차량이 선택되었습니다. 또한 레저용 차량은 데이터 수집을 위해 원격 사이트에 밤새 머무를 수 있는 기능을 제공합니다. 차량의 전면은 변경되지 않았으며 운전 및 수면 공간을 제공합니다 (그림 1B). 기존에 차량 후면에 설치된 침실 어메니티(침대, TV, 수납장)와 쿡탑은 제거되었습니다.
맞춤형 스테인리스 스틸 선반과 80/20 알루미늄 프레임으로 지지되는 맞춤형 석영 조리대가 침실 편의 시설과 쿡탑 대신 설치되었습니다 (그림 1C). 실험실 벤치는 데이터 수집을 위한 적절한 공간을 제공합니다 (그림 1D). 각 장비(예: 냉장 원심분리기, 미토콘드리아 호흡 챔버, 플레이트 판독기, 컴퓨터, 균질기, 저울, 휴대용 초냉동고 및 기타 일반 실험실 용품)의 전력 소비가 고려되었습니다. 원심분리기의 큰 전압 및 전류 수요를 지원하기 위해 전기 시스템을 항공기 등급 장비로 업그레이드했습니다. 차량 후면의 외부 구획은 액체 질소 저장 및 운송에 대한 미국 교통부의 지침을 충족하는 액체 질소 저장 베이로 변환되었습니다. 이 저장 장치는 스테인리스 스틸로 제작되었으며 팽창하는 질소 가스가 차량의 승객실로 누출되는 것을 방지하기 위해 적절한 환기 장치가 있습니다.
모바일 실험실이 미토콘드리아 생체 에너지 연구에 사용될 수 있는지 확인하기 위해 미토콘드리아를 분리하고 야생 유래 집쥐(Mus musculus) 뒷다리 골격근의 미토콘드리아 호흡수를 측정했습니다. Mus musculus는 모델 유기체이기 때문에 이 종의 미토콘드리아 호흡수는12,13,14로 잘 확립되어 있습니다. 이전 연구들이 차등 원심분리를 통한 미토콘드리아 분리를 문서화했지만(15,16,17), 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실 방법에서 사용되는 방법에 대한 간략한 개요가 아래에 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이동식 미토콘드리아 생리학 실험실을 통해 연구원들은 미토콘드리아를 분리하고 원격 현장 현장에서 조직 채취 후 2시간 이내에 미토콘드리아 호흡수를 측정할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 AU MitoMobile에서 수행된 미토콘드리아 호흡의 측정이 대학 연구 실험실에서 수행된 측정과 유사하다는 것을 시사합니다. 구체적으로, 여기에 제시된 야생 유래 Mus musculus에 대한 상태 3, 상태 4 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 AU MitoMobile의 구조 및 전기 의장을 지원한 Auburn University의 Samuel Ginn College of Engineering의 전기 및 컴퓨터 공학과의 Mark Nelms와 John Tennant에게 감사를 표합니다. 또한 저자는 AU MitoMobile을 꾸미기 위한 자금과 Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research(PAIR) 보조금의 연구를 인정합니다.
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
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