Sahada Mitokondriyal Enerjileri Ölçmek için Mobil Mitokondriyal Fizyoloji Laboratuvarının Geliştirilmesi
Summary
Tarla lokasyonlarında yakalanan vahşi hayvanların izole mitokondrilerindeki solunum hızlarını ölçmek için mobil bir laboratuvar tasarladık ve inşa ettik. Burada, mobil bir mitokondriyal laboratuvarın tasarımını ve donanımını ve ilgili laboratuvar protokollerini açıklıyoruz.
Abstract
Mitokondriyal enerji, hayvan biyokimyası ve fizyolojisinde merkezi bir temadır ve araştırmacılar metabolik kapasiteyi araştırmak için mitokondriyal solunumu bir metrik olarak kullanırlar. Mitokondriyal solunum önlemlerini elde etmek için taze biyolojik numuneler kullanılmalı ve tüm laboratuvar prosedürü yaklaşık 2 saat içinde tamamlanmalıdır. Ayrıca, bu laboratuvar tahlillerini gerçekleştirmek için çok sayıda özel ekipman gereklidir. Bu, fizyoloji laboratuvarlarından uzakta yaşayan vahşi hayvanların dokularında mitokondriyal solunumun ölçülmesi için bir zorluk yaratır, çünkü canlı doku sahada toplandıktan sonra çok uzun süre korunamaz. Ayrıca, canlı hayvanların uzun mesafelerde taşınması, mitokondriyal enerjileri değiştirebilen strese neden olur.
Bu el yazması, sahaya götürülebilen ve vahşi hayvanlardan toplanan dokulardaki mitokondriyal metabolizmayı ölçmek için yerinde kullanılabilen mobil bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı olan Auburn Üniversitesi (AU) MitoMobile’ı tanıtmaktadır. Mobil laboratuvarın temel özellikleri ve izole mitokondriyal solunum hızlarını ölçmek için adım adım yöntemler sunulmaktadır. Ek olarak, sunulan veriler, mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarının donatılmasının ve mitokondriyal solunum ölçümlerinin yapılmasının başarısını doğrulamaktadır. Mobil laboratuvarın yeniliği, sahaya gitme ve sahada yakalanan hayvanların dokuları üzerinde mitokondriyal ölçümler yapma yeteneğinde yatmaktadır.
Introduction
Bugüne kadar, mitokondriyal enerjileri ölçmek için tasarlanan çalışmalar, bilim adamlarının göç, dalış ve kış uykusu gibi faaliyetler sırasında hayvanlardan toplanan dokularda mitokondriyal biyoenerjetik çalışmalar yapmasını engelleyen laboratuvar hayvanları veya yerleşik fizyoloji laboratuvarlarının yakınında yakalanan hayvanlarla sınırlıydı 1,2,3,4,5,6 . Birçok araştırmacı yabani hayvanların bazal ve pik metabolizma hızlarını ve günlük enerji harcamalarını başarılı bir şekilde ölçmüşolsa da 7,8, araştırmacıların mitokondri performansını ölçme kapasitesi sınırlı kalmıştır (ancak bkz. 1,4,9). Bu kısmen, mitokondriyi izole etmek için taze dokuya ve taze dokuyu elde ettikten yaklaşık 2 saat sonra izolasyonları gerçekleştirmek için bir laboratuvar tesisine ihtiyaç duyulmasından kaynaklanmaktadır. Mitokondri izole edildikten sonra, mitokondriyal solunum ölçümleri de ~ 1 saat içinde tamamlanmalıdır.
İzole mitokondriyal solunum hızları genellikle bir Clark elektroduna bağlı kapalı bir kapta oksijen konsantrasyonunun ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Bu yöntemin arkasındaki teori, oksidatif fosforilasyon sırasında oksijenin mitokondriyal solunumun son elektron alıcısı olduğu temel gözlemine dayanmaktadır. Bu nedenle, bir deney sırasında oksijen konsantrasyonu düştüğünde, adenozin trifosfat (ATP) üretiminin gerçekleştiği varsayılmaktadır10. Tüketilen oksijen, üretilen ATP için bir vekildir. Araştırmacılar, farklı substratlar kullanarak spesifik deneysel koşullar oluşturabilir ve odaya önceden belirlenmiş miktarlarda ADP ekleyerek adenozin difosfat (ADP) ile uyarılan solunumu (durum 3) başlatabilir. Eksojen ADP’nin ATP’ye fosforilasyonunu takiben, oksijen tüketim oranı azalır ve durum 4’e ulaşılır ve ölçülebilir. Ayrıca, spesifik inhibitörlerin eklenmesi, kaçak solunum ve bağlanmamış solunum ile ilgili bilgilerin elde edilmesini sağlar10. Durum 3’ün durum 4’e oranı, genel mitokondriyal eşleşmenin göstergesi olan solunum kontrol oranını (RCR)belirler 10,11. Daha düşük RCR değerleri genel mitokondriyal disfonksiyonu gösterirken, daha yüksek RCR değerleri daha büyük ölçüde mitokondriyal eşleşme10 olduğunu göstermektedir.
Daha önce belirtildiği gibi, biyolojik materyalin toplanması, mitokondriyal izolasyon ve solunum hızlarının ölçümü, doku elde edildikten sonraki 2 saat içinde tamamlanmalıdır. Hayvanları uzun mesafelerde kurulu laboratuvarlara taşımadan bu görevi yerine getirmek için, bu verilerin toplanabileceği saha konumlarına götürülmek üzere mobil bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı inşa edildi. 2018 Jayco Redhawk eğlence aracı, mobil bir moleküler fizyoloji laboratuvarına dönüştürüldü ve Auburn Üniversitesi (AU) MitoMobile olarak adlandırıldı (Şekil 1A). Ankastre buzdolabı, derin dondurucu, su depolama tankı ve sıhhi tesisat, 12 voltluk pillerle çalışan elektrik, gaz jeneratörü, propan tankı ve otomatik tesviye sistemi nedeniyle bir eğlence aracı seçildi. Ayrıca, eğlence aracı, veri toplama için gece boyunca uzak sitelerde kalma yeteneği sağlar. Aracın ön kısmı değiştirilmemiştir ve sürüş ve uyku alanlarını sağlar (Şekil 1B). Aracın arkasına ve set üstü ocakta daha önce kurulmuş yatak odası olanakları (yatak, TV ve dolap) kaldırıldı.
Yatak odası malzemeleri ve set üstü ocak yerine özel yapım paslanmaz çelik raflar ve 80/20 alüminyum çerçeve ile desteklenen özel bir kuvars tezgah yerleştirildi (Şekil 1C). Laboratuvar tezgahları veri toplama için yeterli alan sağlar (Şekil 1D). Her bir ekipmanın (yani soğutmalı santrifüj, mitokondriyal solunum odaları, plaka okuyucular, bilgisayarlar, homojenizatörler, teraziler, taşınabilir ultra dondurucu ve diğer genel laboratuvar malzemeleri) güç tüketimi dikkate alınmıştır. Santrifüjün büyük voltaj ve akım taleplerini desteklemek için, elektrik sistemi uçak sınıfı ekipmanınkine yükseltildi. Aracın arkasındaki harici bir bölme, Amerika Birleşik Devletleri Ulaştırma Bakanlığı’nın sıvı nitrojen depolama ve taşıma yönergelerini karşılayan bir sıvı nitrojen depolama bölmesine dönüştürüldü. Bu depolama ünitesi paslanmaz çelikten yapılmıştır ve genişleyen nitrojen gazının aracın yolcu bölmesine sızmasını önlemek için uygun havalandırmaya sahiptir.
Mobil laboratuvarın mitokondriyal biyoenerjetik çalışmalarda kullanılabileceğini doğrulamak için mitokondri izole edildi ve yabani kaynaklı ev farelerinden (Mus musculus) arka bacak iskelet kasından mitokondriyal solunum hızları ölçüldü. Mus musculus model bir organizma olduğu için bu türün mitokondriyal solunum hızları iyi bilinmektedir12,13,14. Önceki çalışmalarda diferansiyel santrifüjleme yoluyla mitokondriyal izolasyonbelgelenmiş olsa da 15,16,17, mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvar yöntemlerinde kullanılan yöntemlere kısa bir genel bakış aşağıda açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı, araştırmacıların mitokondriyi izole etmelerini ve uzak saha sahalarında doku toplandıktan sonraki 2 saat içinde mitokondriyal solunum hızlarını ölçmelerini sağlar. Burada sunulan sonuçlar, AU MitoMobile’da yapılan mitokondriyal solunum ölçümlerinin bir üniversite araştırma laboratuvarında yapılan ölçümlerle karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Spesifik olarak, burada sunulan yabani kaynaklı Mus musculus için durum 3, durum 4 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Auburn Üniversitesi Samuel Ginn Mühendislik Fakültesi Elektrik ve Bilgisayar Mühendisliği bölümünden Mark Nelms ve John Tennant’a AU MitoMobile’ın yapısal ve elektrik donanımına yardımcı oldukları için teşekkür ediyor. Ek olarak, yazarlar AU MitoMobile’ı donatmak için fon sağladığını ve Auburn Üniversitesi Başkanlık Disiplinlerarası Araştırma Ödülleri (PAIR) hibesinden araştırma yaptığını kabul ediyor.
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
