Utveckling av ett mobilt mitokondriellt fysiologiskt laboratorium för mätning av mitokondriell energi i fält
Summary
Vi designade och konstruerade ett mobilt laboratorium för att mäta andningsfrekvensen i isolerade mitokondrier hos vilda djur som fångats på fältplatser. Här beskriver vi design och utrustning av ett mobilt mitokondrielaboratorium och tillhörande laboratorieprotokoll.
Abstract
Mitokondriell energi är ett centralt tema inom djurbiokemi och fysiologi, med forskare som använder mitokondriell andning som ett mått för att undersöka metabolisk förmåga. För att få mått på mitokondriell andning måste färska biologiska prover användas, och hela laboratorieproceduren måste slutföras inom cirka 2 timmar. Dessutom krävs flera delar av specialutrustning för att utföra dessa laboratorieanalyser. Detta skapar en utmaning för att mäta mitokondriell andning i vävnader från vilda djur som lever långt från fysiologiska laboratorier eftersom levande vävnad inte kan bevaras särskilt länge efter insamling i fält. Att transportera levande djur över långa sträckor orsakar dessutom stress, vilket kan förändra mitokondriernas energi.
Detta manuskript introducerar Auburn University (AU) MitoMobile, ett mobilt mitokondriellt fysiologilaboratorium som kan tas in i fält och användas på plats för att mäta mitokondriell metabolism i vävnader som samlats in från vilda djur. Det mobila laboratoriets grundläggande egenskaper och steg-för-steg-metoder för att mäta isolerade mitokondriella andningsfrekvenser presenteras. Dessutom validerar de data som presenteras framgången med att utrusta det mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriet och göra mitokondriella andningsmätningar. Det nya med det mobila laboratoriet ligger i möjligheten att köra till fältet och utföra mitokondriella mätningar på vävnader från djur som fångats på plats.
Introduction
Hittills har studier som är utformade för att mäta mitokondriell energi begränsats till försöksdjur eller djur som fångats nära etablerade fysiologiska laboratorier, vilket uteslutit forskare från att utföra mitokondriella bioenergetiska studier i vävnader som samlats in från djur under sådana aktiviteter som migration, dykning och övervintring 1,2,3,4,5,6 . Medan många forskare framgångsrikt har mätt de basala och maximala ämnesomsättningshastigheterna och den dagliga energiförbrukningen hos vilda djur 7,8, har forskarnas kapacitet att mäta mitokondriernas prestanda förblivit begränsad (se 1,4,9). Detta beror delvis på behovet av färsk vävnad för att isolera mitokondrier och en laboratorieanläggning för att utföra isoleringarna inom cirka 2 timmar efter att den färska vävnaden erhållits. När mitokondrierna har isolerats bör även mätningarna av mitokondriernas andning slutföras inom ~1 timme.
Isolerade mitokondriella andningshastigheter utförs vanligtvis genom att mäta syrekoncentrationen i en förseglad behållare ansluten till en Clark-elektrod. Teorin bakom denna metod bygger på den grundläggande observationen att syre är den sista elektronacceptorn för mitokondriell andning under oxidativ fosforylering. Därför, när syrekoncentrationen sjunker under ett experiment, antas det att produktion av adenosintrifosfat (ATP) sker10. Förbrukat syre är en proxy för producerad ATP. Forskare kan skapa specifika experimentella förhållanden med hjälp av olika substrat och initiera adenosindifosfat (ADP)-stimulerad andning (tillstånd 3) genom att tillsätta förutbestämda mängder ADP till kammaren. Efter fosforyleringen av den exogena ADP till ATP minskar syreförbrukningen och tillstånd 4 uppnås och kan mätas. Dessutom gör tillsatsen av specifika inhibitorer det möjligt att få information om läckagerespiration och okopplad respiration10. Förhållandet mellan tillstånd 3 och tillstånd 4 bestämmer andningskontrollförhållandet (RCR), som är indikatorn för den totala mitokondriella kopplingen10,11. Lägre värden på RCR indikerar övergripande mitokondriell dysfunktion, medan högre RCR-värden tyder på en större grad av mitokondriell koppling10.
Som tidigare nämnts måste insamlingen av biologiskt material, mitokondriell isolering och mätning av andningshastigheter slutföras inom 2 timmar efter att vävnaden erhållits. För att utföra denna uppgift utan att transportera djur över stora avstånd till etablerade laboratorier, konstruerades ett mobilt mitokondriefysiologiskt laboratorium för att tas till fältplatser där dessa data kan samlas in. En Jayco Redhawk fritidsbil från 2018 omvandlades till ett mobilt laboratorium för molekylär fysiologi och döptes till Auburn University (AU) MitoMobile (figur 1A). Ett fritidsfordon valdes på grund av den inbyggda kylen, frysen, vattentanken och VVS, el som drivs av 12-voltsbatterier, gasgenerator, propantank och självnivellerande system. Dessutom ger fritidsfordonet möjlighet att stanna på avlägsna platser över natten för datainsamling. Fordonets front har inte ändrats och utgör kör- och sovplats (figur 1B). Tidigare installerade sovrumsbekvämligheter (säng, TV och skåp) i den bakre delen av fordonet och spishällen togs bort.
Specialtillverkade hyllor i rostfritt stål och en anpassad bänkskiva i kvarts som stöds av 80/20 aluminiumram installerades i stället för sovrumsbekvämligheterna och spishällen (Figur 1C). Laboratoriebänkarna ger tillräckligt med utrymme för datainsamling (figur 1D). Hänsyn togs till energiförbrukningen för varje utrustning (t.ex. kylcentrifug, mitokondriella andningskammare, plattläsare, datorer, homogenisatorer, vågar, bärbar ultrafrys och andra allmänna laboratorietillbehör). För att klara centrifugens stora spännings- och strömbehov uppgraderades det elektriska systemet till utrustning av flygplanskvalitet. Ett externt fack i den bakre delen av fordonet omvandlades till ett förvaringsfack för flytande kväve, som uppfyller USA:s transportdepartements riktlinjer för lagring och transport av flytande kväve. Denna förvaringsenhet är konstruerad av rostfritt stål och har ordentlig ventilation för att förhindra att expanderande kvävgas läcker in i fordonets passagerarutrymme.
För att bekräfta att det mobila laboratoriet kan användas i mitokondriella bioenergetiska studier isolerades mitokondrier och mitokondriell respirationsfrekvens från vildhärledda husmöss (Mus musculus) bakbensskelettmuskulatur mättes. Eftersom Mus musculus är en modellorganism är mitokondriernas andningsfrekvens för denna art väletablerad12,13,14. Även om tidigare studier har dokumenterat mitokondriell isolering via differentiell centrifugering15,16,17, beskrivs nedan en kort översikt över de metoder som används i de mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriemetoderna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriet gör det möjligt för forskare att isolera mitokondrier och mäta mitokondriell andningsfrekvens inom 2 timmar efter vävnadsinsamling på avlägsna fältplatser. Resultaten som presenteras här tyder på att mätningar av mitokondriell andning som görs i AU MitoMobile är jämförbara med mätningar som görs i ett universitets forskningslaboratorium. Specifikt är värdena för tillstånd 3, tillstånd 4 och RCR för vildhärledda Mus musculus som presenter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Mark Nelms och John Tennant från avdelningen för elektro- och datateknik vid Samuel Ginn College of Engineering vid Auburn University för att ha hjälpt till med den strukturella och elektriska utrustningen av AU MitoMobile. Dessutom erkänner författarna finansieringen för att utrusta AU MitoMobile och forskning från ett Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR) -anslag.
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
