Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.
Abstract
Muggengenbewerking is routine geworden in verschillende laboratoria met de oprichting van systemen zoals transcriptie-activator-achtige effectornucleasen (TALENs), zinkvingernucleasen (ZFN’s) en homing-endonucleasen (HE’s). Meer recent heeft geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9) -technologie een eenvoudiger en goedkoper alternatief geboden voor precisiegenoomtechnologie. Na nuclease-actie zullen DNA-reparatieroutes de gebroken DNA-uiteinden repareren, vaak met indels. Deze out-of-frame mutaties worden vervolgens gebruikt voor het begrijpen van de genfunctie in de doelorganismen. Een nadeel is echter dat mutante individuen geen dominante marker dragen, waardoor identificatie en tracking van mutante allelen een uitdaging is, vooral op schalen die nodig zijn voor veel experimenten.
Hoge resolutie smeltanalyse (HRMA) is een eenvoudige methode om variaties in nucleïnezuursequenties te identificeren en maakt gebruik van PCR-smeltcurven om dergelijke variaties te detecteren. Deze post-PCR-analysemethode maakt gebruik van fluorescerende dubbelstrengs DNA-bindende kleurstoffen met instrumentatie die de mogelijkheid heeft om gegevens vast te leggen op temperatuurstijgingen en eenvoudig kan worden geschaald naar 96-well plaatformaten. Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven met behulp van HRMA voor de snelle detectie van CRISPR / Cas9-geïnduceerde indels en het opzetten van mutantenlijnen in de mug Ae. aegypti. Kritisch is dat alle stappen kunnen worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid beenweefsel en niet vereisen dat het organisme wordt opgeofferd, waardoor genetische kruisingen of fenotyperingstests kunnen worden uitgevoerd na genotypering.
Introduction
Als vectoren van pathogenen zoals dengue1, Zika2 en chikungunya3 virussen, evenals malariaparasieten4, vormen muggen een aanzienlijke bedreiging voor de volksgezondheid voor de mens. Voor al deze ziekten is er een aanzienlijke focus van transmissie-interventie op de bestrijding van muggenvectoren. Studie van de genen die belangrijk zijn in bijvoorbeeld toegeeflijkheid voor pathogenen, muggenconditie, overleving, voortplanting en resistentie tegen insecticiden is de sleutel tot het ontwikkelen van nieuwe muggenbestrijdingsstrategieën. Voor dergelijke doeleinden wordt genoombewerking bij muggen een gangbare praktijk, vooral met de ontwikkeling van technologieën zoals HEs, ZFN’s, TALENs en meest recent CRISPR met Cas9. De vestiging van gen-bewerkte stammen omvat meestal het terugkruisen van individuen die de gewenste mutaties gedurende een paar generaties dragen om off-target en founder (bottleneck) effecten te minimaliseren, gevolgd door het kruisen van heterozygote individuen om homozygote of trans-heterozygote lijnen te genereren. Bij afwezigheid van een dominante marker is moleculaire genotypering noodzakelijk in dit proces omdat in veel gevallen geen duidelijke fenotypische eigenschappen kunnen worden gedetecteerd voor heterozygote mutanten.
Hoewel sequencing de gouden standaard is voor genotypische karakterisering, brengt het uitvoeren van dit over honderden of mogelijk duizenden individuen aanzienlijke kosten, arbeid en tijd met zich mee die nodig zijn om resultaten te verkrijgen, wat vooral van cruciaal belang is voor organismen met een korte levensduur zoals muggen. Veelgebruikte alternatieven zijn Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 en hoge resolutie smeltanalyse (HRMA, beoordeeld in 7). Zowel SNA als T7E1 gebruiken endonucleases die alleen niet-overeenkomende bases splitsen. Wanneer een gemuteerd gebied van het heterozygote mutante genoom wordt versterkt, worden DNA-fragmenten van mutante en wild-type allelen gegloeid om niet-overeenkomend dubbelstrengs DNA (dsDNA) te maken. SNA detecteert de aanwezigheid van mismatches via de spijsvertering met een mismatch-specifieke endonuclease en eenvoudige agarose gel elektroforese. Als alternatief gebruikt HRMA de thermodynamische eigenschappen van dsDNA gedetecteerd door dsDNA-bindende fluorescerende kleurstoffen, waarbij de disassociatietemperatuur van de kleurstof varieert op basis van de aanwezigheid en het type mutatie. HRMA is onder andere gebruikt voor de detectie van single-nucleotide polymorfismen (SNP’s)8, mutante genotypering van zebravissen9, microbiologische toepassingen10 en plantengenetisch onderzoek11.
Dit artikel beschrijft HRMA, een eenvoudige methode van moleculaire genotypering voor gemuteerde muggen gegenereerd door CRISPR / Cas9-technologie. De voordelen van HRMA ten opzichte van alternatieve technieken omvatten 1) flexibiliteit, omdat het nuttig is gebleken voor verschillende genen, een breed scala aan indelgroottes, evenals het onderscheid tussen verschillende indelgroottes en heterozygote, homozygote en trans-heterozygote differentiatie12,13,14, 2) kosten, omdat het is gebaseerd op veelgebruikte PCR-reagentia, en 3) tijdbesparend, omdat het in slechts een paar uur kan worden uitgevoerd. Bovendien gebruikt het protocol een klein lichaamsdeel (een poot) als bron van DNA, waardoor de mug het genotyperingsproces kan overleven, waardoor mutantenlijnen kunnen worden opgezet en onderhouden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Smeltanalyse met hoge resolutie biedt een eenvoudige en snelle oplossing voor de identificatie van dedels die worden gegenereerd door CRISPR/Cas9-technologie in de vectormug Ae. aegypti. Het biedt flexibiliteit, waardoor de genotypering van muggen gemuteerd voor een breed scala aan genen mogelijk is, van vliegspier tot ijzermetabolisme en meer13,14. HRMA kan in slechts enkele uren worden uitgevoerd, van monsterverzameling tot de eindanalyses. Extra tijd …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle figuren zijn gemaakt met Biorender.com onder een licentie aan de Texas A & M University. Dit werk werd ondersteund door fondsen van het National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 en AI115138 tot Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research onder het Insect Vectored Disease Grant Program en het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-project 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , 160 (2009).
- WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020)
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O’Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
