Summary

Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

Published: September 10, 2021
doi:

Summary

Este artigo detalha um protocolo para identificação rápida de indels induzidos pelo CRISPR/Cas9 e seleção de linhas mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de derretimento de alta resolução.

Abstract

A edição de genes de mosquitos tornou-se rotina em vários laboratórios com o estabelecimento de sistemas como nucleases efeitos (TALENs) de ativação de transcrição, núcleos de dedo de zinco (ZFNs) e endonucleases (HEs). Mais recentemente, a tecnologia de repetições palindômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/CRISPR(Cas9) ofereceu uma alternativa mais fácil e barata para a engenharia de genomas de precisão. Após a ação nuclease, as vias de reparação de DNA consertarão as extremidades de DNA quebradas, muitas vezes introduzindo indels. Essas mutações fora do quadro são então usadas para entender a função genética nos organismos alvo. Uma desvantagem, no entanto, é que indivíduos mutantes não carregam nenhum marcador dominante, tornando a identificação e o rastreamento de alelos mutantes desafiadores, especialmente em escalas necessárias para muitos experimentos.

A análise de derretimento de alta resolução (HRMA) é um método simples para identificar variações nas sequências de ácido nucleico e utiliza curvas de fusão pcr para detectar tais variações. Este método de análise pós-PCR usa corantes fluorescentes de ligação de DNA de dupla fita com instrumentação que tem capacidade de captura de dados de controle de rampa de temperatura e é facilmente dimensionado para formatos de placas de 96 poços. Descrito aqui é um simples fluxo de trabalho utilizando o HRMA para a detecção rápida de indeles induzidos pelo CRISPR/Cas9 e o estabelecimento de linhas mutantes no mosquito Ae. aegypti. Criticamente, todas as etapas podem ser realizadas com uma pequena quantidade de tecido da perna e não requerem o sacrifício do organismo, permitindo que cruzes genéticas ou ensaios de fenotipagem sejam realizados após a genotipagem.

Introduction

Como vetores de patógenos como os vírus da dengue1, zika2 e chikungunya3, bem como parasitas maláricos4, os mosquitos representam uma ameaça significativa à saúde pública para os seres humanos. Para todas essas doenças, há um foco substancial de intervenção de transmissão no controle de mosquitos vetores. O estudo dos genes importantes, por exemplo, na permissividade aos patógenos, na aptidão dos mosquitos, na sobrevivência, na reprodução e na resistência aos inseticidas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias de controle de mosquitos. Para tais efeitos, a edição de genomas em mosquitos está se tornando uma prática comum, especialmente com o desenvolvimento de tecnologias como HEs, ZFNs, TALENs e, mais recentemente, CRISPR com Cas9. O estabelecimento de cepas editadas por genes normalmente envolve o backcrossing de indivíduos que carregam as mutações desejadas por algumas gerações para minimizar efeitos fora do alvo e fundador (gargalo), seguido pela travessia de indivíduos heterozigosos para gerar linhas homozigosas ou trans-heterozigosas. Na ausência de um marcador dominante, a genotipagem molecular é necessária nesse processo porque, em muitos casos, não podem ser detectados traços fenotípicos claros para mutantes heterozigosos.

Embora o sequenciamento seja o padrão-ouro para a caracterização genotipípica, realizar isso em centenas, ou possivelmente milhares de indivíduos, representa custos significativos, mão-de-obra e tempo necessários para obter resultados, o que é especialmente crítico para organismos com vida útil curta, como mosquitos. Alternativas comumente utilizadas são Surveyor nuclease assay5 (SNA), ensaio T7E1 e análise de derretimento de alta resolução (HRMA, revisado in7). Tanto o SNA quanto o T7E1 usam endonucleases que apenas se descompatem bases incompatíveis. Quando uma região mutante mutante mutada do genoma mutante heterozigoso é amplificada, fragmentos de DNA de alelos mutantes e do tipo selvagem são enais para fazer DNA de dupla cadeia incompatível (dsDNA). A SNA detecta a presença de incompatibilidades via digestão com uma endonuclease específica de incompatibilidade e eletroforese de gel de agarose simples. Alternativamente, o HRMA utiliza as propriedades termodinâmicas do dsDNA detectadas por corantes fluorescentes de ligação dsDNA, com a temperatura de dissociação do corante variando com base na presença e tipo de mutação. O HRMA tem sido utilizado para a detecção de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs)8, genotipagem mutante de peixe-zebra9, aplicações microbiológicas10 e pesquisa genética vegetal11, entre outros.

Este artigo descreve o HRMA, um método simples de genotipagem molecular para mosquitos mutantes gerado pela tecnologia CRISPR/Cas9. As vantagens do HRMA sobre técnicas alternativas incluem 1) flexibilidade, pois tem sido comprovadamente útil para vários genes, uma ampla gama de tamanhos indel, bem como a distinção entre diferentes tamanhos indel e heterozigous, homozygous e trans-heterozygous diferenciação12,13,14, 2) custo, pois é baseado em reagentes PCR comumente usados, e 3) economia de tempo, como pode ser realizado em apenas algumas horas. Além disso, o protocolo utiliza uma pequena parte do corpo (uma perna) como fonte de DNA, permitindo que o mosquito sobreviva ao processo de genotipagem, permitindo o estabelecimento e manutenção de linhas mutantes.

Protocol

1. Digitalização para polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs), projeto de primer HRMA e validação do primer Identificação do SNP em mosquitos de colônia de laboratório silvestreSelecione o exon de destino para interromper a tradução adequada do polipeptídeo.NOTA: O alvo deve estar próximo do códon inicial ou entre os principais resíduos necessários para a função proteica. Quanto menor o exon (por exemplo, ≤200 bases), mais difícil é mirar e analisar. Evite editar perto dos…

Representative Results

Mosquitos contendo mutações nos genes AaeZIP11 (transporte de ferro putativo21) e mio-fem (gene de miosina tendenciosa da fêmea relacionado aos músculos de voo13) foram obtidos utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, genótipo usando HRMA e sequência verificada (Figura 5). As amostras mutantes Figura 5A e Figura 5C mostram a intensidade de fluorescência normalizada…

Discussion

A análise de derretimento de alta resolução oferece uma solução simples e rápida para a identificação de indels gerados pela tecnologia CRISPR/Cas9 no mosquito vetor Ae. aegypti. Ele fornece flexibilidade, permitindo a genotipagem de mosquitos mutados para uma ampla gama de genes, desde o músculo de voo até o metabolismo do ferro e mais 13,14. O HRMA pode ser realizado em apenas algumas horas, desde a coleta de amostras até as análises finais…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Todos os números foram criados com Biorender.com sob licença para a Texas A&M University. Este trabalho foi apoiado por fundos do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (AI137112 e AI115138 a Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research sob o Insect Vectored Disease Grant Program, e o UsDA National Institute of Food and Agriculture, projeto Hatch 1018401.

Materials

70% Ethanol 70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates VWR 82006-636 For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96 Bio Rad PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs VWR 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit New England Biolabs E1050S
Glass Petri Dish VWR 89001-246 150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates Bio-rad HSP9665 For HRMA
Multi-channel pipettor (P10) Integra Biosciences 4721
Multi-channel pipettor (P300) Integra Biosciences 4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific VWR 37000-548 To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape Bio-rad 2239444 To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) Thermo Fisher F140WH For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers Genesee 59-128W
Precision Melt Analysis Software Bio Rad 1845025 Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro DNAstar Lasergene software For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm WPI 14098
White foam plugs VWR 60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene Genesee 32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue Genesee 59-164B

References

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Cite This Article
Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes, E., O’Leary, S., Adelman, Z. N. Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (175), e63008, doi:10.3791/63008 (2021).

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