Summary

Обнаружение Indel после мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием анализа расплава высокого разрешения у комаров Aedes aegypti

Published: September 10, 2021
doi:

Summary

В этой статье подробно описывается протокол быстрой идентификации инделов, индуцированных CRISPR/Cas9, и выбора мутантных линий у комара Aedes aegypti с использованием анализа расплава с высоким разрешением.

Abstract

Редактирование генов комаров стало обычным делом в нескольких лабораториях с созданием таких систем, как транскрипционно-активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs), нуклеазы цинкового пальца (ZFNs) и самонаводящиеся эндонуклеазы (HEs). Совсем недавно технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9) предложила более простую и дешевую альтернативу для точной геномной инженерии. После действия нуклеазы пути репарации ДНК будут исправлять сломанные концы ДНК, часто вводя индели. Эти внекадровые мутации затем используются для понимания функции генов в целевых организмах. Недостатком, однако, является то, что мутантные особи не несут доминирующего маркера, что затрудняет идентификацию и отслеживание аллелей мутантов, особенно в масштабах, необходимых для многих экспериментов.

Анализ расплава с высоким разрешением (HRMA) является простым методом выявления вариаций последовательностей нуклеиновых кислот и использует кривые плавления ПЦР для обнаружения таких изменений. Этот метод анализа после ПЦР использует флуоресцентные двухцепочечные ДНК-связывающие красители с приборами, которые имеют возможность сбора данных о контроле температуры и легко масштабируются до форматов пластин с 96 лунками. Здесь описан простой рабочий процесс с использованием HRMA для быстрого обнаружения CRISPR/Cas9-индуцированных инделей и установления мутантных линий у комара Ae. aegypti. Критически важно, что все этапы могут быть выполнены с небольшим количеством ткани ноги и не требуют жертвоприношения организма, позволяя проводить генетические скрещивания или фенотипирование после генотипирования.

Introduction

Как переносчики патогенов, таких как вирусы денге1, Зика2 и чикунгунья3, а также малярийные паразиты4, комары представляют значительную угрозу для здоровья людей. В связи со всеми этими заболеваниями основное внимание уделяется мерам по борьбе с комарами-переносчиками. Изучение генов, важных, например, в отношении вседозволенности к патогенам, приспособленности комаров, выживания, размножения и устойчивости к инсектицидам, является ключом к разработке новых стратегий борьбы с комарами. Для таких целей редактирование генома у комаров становится обычной практикой, особенно с развитием таких технологий, как HEs, ZFN, TALENs и совсем недавно CRISPR с Cas9. Создание генетически отредактированных штаммов обычно включает в себя обратное скрещивание людей, несущих желаемые мутации в течение нескольких поколений, чтобы свести к минимуму нецелевые и фаундокторные (узкие места) эффекты, с последующим скрещиванием гетерозиготных особей для генерации гомозиготных или трансгетерозиготных линий. В отсутствие доминирующего маркера молекулярное генотипирование необходимо в этом процессе, поскольку во многих случаях у гетерозиготных мутантов не может быть обнаружено четких фенотипических признаков.

Хотя секвенирование является золотым стандартом для генотипической характеристики, выполнение этого для сотен или, возможно, тысяч особей сопряжено со значительными затратами, трудом и временем, необходимыми для получения результатов, что особенно важно для организмов с короткой продолжительностью жизни, таких как комары. Обычно используемыми альтернативами являются Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 и анализ расплава с высоким разрешением (HRMA, рассмотрено в 7). И SNA, и T7E1 используют эндонуклеазы, которые расщепляют только несоответствующие основания. Когда мутированная область гетерозиготного мутантного генома амплифицируется, фрагменты ДНК из аллелей мутантного и дикого типа отжигаются, чтобы сделать несоответствующую двухцепочечную ДНК (dsDNA). СНС обнаруживает наличие несоответствий через пищеварение с несоответствующей специфической эндонуклеазой и простым электрофорезом агарозного геля. В качестве альтернативы HRMA использует термодинамические свойства dsDNA, обнаруженные флуоресцентными красителями, связывающими dsDNA, при этом температура диссоциации красителя изменяется в зависимости от наличия и типа мутации. HRMA использовался для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)8, мутантного генотипирования рыб данио9, микробиологических приложений10 и генетических исследований растений11.

В этой статье описывается HRMA, простой метод молекулярного генотипирования для комаров-мутантов, генерируемый технологией CRISPR / Cas9. Преимущества HRMA перед альтернативными методами включают в себя 1) гибкость, поскольку она доказала свою полезность для различных генов, широкий диапазон размеров инделя, а также различие между различными размерами инделя и гетерозиготной, гомозиготной и трансгетерозиговой дифференцировкой12,13,14, 2) стоимость, поскольку она основана на широко используемых реагентах ПЦР, и 3) экономию времени, так как это может быть выполнено всего за несколько часов. Кроме того, протокол использует небольшую часть тела (ногу) в качестве источника ДНК, что позволяет комару выжить в процессе генотипирования, позволяя устанавливать и поддерживать мутантные линии.

Protocol

1. Сканирование на наличие однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), проектирование праймера HRMA и валидация праймера Идентификация SNP у комаров лабораторных колоний дикого типаВыберите целевой экзон, чтобы нарушить правильную трансляцию полипептидов.ПРИМЕЧАНИЕ: Мишень должна б…

Representative Results

Комары, содержащие мутации в генах AaeZIP11 (предполагаемый транспортер железа21) и мио-фем (ген миозина с женским уклоном, связанный с летными мышцами13), были получены с использованием технологии CRISPR/Cas9, генотипированы с использованием HRMA и проверены посл…

Discussion

Анализ расплава с высоким разрешением предлагает простое и быстрое решение для идентификации инделей, генерируемых технологией CRISPR/Cas9 в комаре-переносчике Ae. aegypti. Он обеспечивает гибкость, позволяя генотипировать комаров, мутировавших для широкого спектра генов от мышц полета д?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Все фигуры были созданы с Biorender.com по лицензии Техасского университета A&M. Эта работа была поддержана средствами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (AI137112 и AI115138 до Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research в рамках Программы грантов на переносчики насекомых и Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, проект Хэтч 1018401.

Materials

70% Ethanol 70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates VWR 82006-636 For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96 Bio Rad PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs VWR 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit New England Biolabs E1050S
Glass Petri Dish VWR 89001-246 150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates Bio-rad HSP9665 For HRMA
Multi-channel pipettor (P10) Integra Biosciences 4721
Multi-channel pipettor (P300) Integra Biosciences 4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific VWR 37000-548 To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape Bio-rad 2239444 To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) Thermo Fisher F140WH For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers Genesee 59-128W
Precision Melt Analysis Software Bio Rad 1845025 Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro DNAstar Lasergene software For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm WPI 14098
White foam plugs VWR 60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene Genesee 32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue Genesee 59-164B

References

  1. WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , 160 (2009).
  2. WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
  3. WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
  4. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020)
  5. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  6. Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
  7. Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
  8. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
  9. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  10. Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
  11. Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
  12. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  13. O’Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
  14. Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
  15. Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  16. Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
  17. Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
  18. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  20. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  21. Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
  22. Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
  23. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).

Play Video

Cite This Article
Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes, E., O’Leary, S., Adelman, Z. N. Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (175), e63008, doi:10.3791/63008 (2021).

View Video