Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón
Summary
Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.
Abstract
Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) son células endoteliales especializadas ubicadas en la interfaz entre la circulación y el parénquima hepático. Los LSEC tienen una morfología distinta caracterizada por la presencia de fenestras y la ausencia de membrana basal. Los LSEC desempeñan un papel esencial en muchos trastornos patológicos en el hígado, incluida la desregulación metabólica, la inflamación, la fibrosis, la angiogénesis y la carcinogénesis. Sin embargo, poco se ha publicado sobre el aislamiento y la caracterización de los LSEC. Aquí, este protocolo discute el aislamiento de LSEC de ratones sanos y sin enfermedad del hígado graso (NAFLD). El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y perlas magnéticas de selección positiva de células no pares para purificar LSEC. Este estudio caracteriza los LSEC utilizando marcadores específicos por citometría de flujo e identifica las características fenotípicas características mediante microscopía electrónica de barrido. Los LSEC aislados siguiendo este protocolo se pueden utilizar para estudios funcionales, incluidos ensayos de adhesión y permeabilidad, así como estudios posteriores para una vía particular de interés. Además, estos LSEC se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos, incluida la generación de datos RNA-seq a granel o unicelular, proteómica o fosfoprotómica, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq), entre otros. Este protocolo será útil para los investigadores que estudian la comunicación de los LSEC con otras células hepáticas en la salud y la enfermedad y permitirá una comprensión profunda del papel de los LSEC en los mecanismos patógenos de la lesión hepática aguda y crónica.
Introduction
Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSAC) recubren las paredes sinusoides hepáticas y son las células no parenquimatosas más abundantes en el hígado1. Los LSEC se distinguen de otras células endoteliales capilares en otras partes del cuerpo por la presencia de fenestras y la falta de una membrana basal clásica o un diafragma 2,3. Por lo tanto, los LSEC poseen características fenotípicas y estructurales distintivas que mejoran su permeabilidad y capacidad endocítica para eliminar una variedad de macromoléculas circulantes, incluidos los lípidos y las lipoproteínas. Los LSEC desempeñan un papel fundamental en la diafonía entre las células parenquimatosas y no parenquimatosas, como las células estrelladas y las células inmunes. Los LSEC son clave para mantener la homeostasis hepática al mantener las células estrelladas y las células de Kupffer en un estado de reposo4. Los LSEC modulan la composición de las poblaciones de células inmunes hepáticas mediando la adhesión y la migración transendotelial de los leucocitos circulantes 5,6. Durante la lesión hepática aguda y crónica 7, incluidala lesión por isquemia-reperfusión (IRI)8, la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA)9 y el carcinoma hepatocelular (CHC), los LSEC experimentan cambios fenotípicos conocidos como capilarización caracterizados por la defenestración y la formación de la membrana basal10. Estos cambios fenotípicos en los LSEC están asociados con la disfunción de los LSEC y la adquisición de propiedades protrombóticas, proinflamatorias y profibrogénicas.
Se han desarrollado varios métodos para el aislamiento de LSECs del hígado de ratón11. Algunas técnicas dependen de la separación de células no parenquimatosas y parenquimatosas seguidas de centrifugación por gradiente de densidad para purificar los LSEC de las fracciones no paresquimatosas. La limitación de este método es la presencia de macrófagos contaminantes en los pasos finales del aislamiento de LSECs, lo que podría afectar la pureza de los LSECs aislados12. Este protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y en la selección positiva de perlas magnéticas CD146+ de células no paresquimatosas para purificar LSAC. Los LSEC aislados utilizando este método muestran alta pureza y conservan morfología y viabilidad. Estos LSEC son óptimos para estudios funcionales, incluidos los ensayos de permeabilidad y adhesión, así como para estudios posteriores para vías de interés. Además, con el creciente interés en generar grandes conjuntos de datos tanto en la investigación clínica como en la ciencia del descubrimiento, estos LSEC de alta calidad aislados de hígados sanos y enfermos con esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) u otras afecciones se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos y la comparación entre la salud y la enfermedad13,14 . Además, los LSEC aislados se pueden emplear para desarrollar modelos bidimensionales y tridimensionales in vitro como organoides para descifrar la vía de señalización activada en LSEC y su comunicación intercelular con otras células hepáticas bajo diferentes estímulos nocivos y en respuesta a diversas intervenciones terapéuticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el manuscrito actual, describimos un protocolo para el aislamiento de LSEC del hígado de ratón que consiste en la perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este protocolo consta de los siguientes tres pasos: (1) Perfusión a través del PV con un tampón libre de calcio seguido de un tampón que contiene colagenasa para lograr la dispersión de las células hepáticas; (2) Exclusión de hepatocitos con centrifugación de baja velocidad; y (3) selecci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los NIH (1RO1DK122948 a SHI) y el mecanismo de subvención P30 de los NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers (DK084567). La Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) también prestó apoyo a KF en las becas de investigación en el extranjero. También nos gustaría reconocer al Dr. Gregory J. Gores y Steven Bronk por su diseño original y optimización del aparato de perfusión de colagenasa.
Materials
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
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