Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu
Summary
Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC’leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.
Abstract
Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC’ler), dolaşım ve karaciğer parankimi arasındaki arayüzde yer alan özelleşmiş endotel hücreleridir. LSEC’ler, fenestra varlığı ve bazal membranın yokluğu ile karakterize edilen farklı bir morfolojiye sahiptir. LSEC’ler, metabolik disregülasyon, inflamasyon, fibroz, anjiyogenez ve karsinogenez dahil olmak üzere karaciğerdeki birçok patolojik bozuklukta önemli rol oynamaktadır. Bununla birlikte, LSEC’lerin izolasyonu ve karakterizasyonu hakkında çok az şey yayınlanmıştır. Burada, bu protokol LSEC’in hem sağlıklı hem de alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) farelerinden izolasyonunu tartışmaktadır. Protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC’leri saflaştırmak için manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu çalışma, akış sitometrisi ile spesifik belirteçler kullanarak LSEC’leri karakterize eder ve elektron mikroskobu taraması ile karakteristik fenotipik özellikleri tanımlar. Bu protokolü takiben izole edilen LSEC’ler, yapışma ve geçirgenlik testleri de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra belirli bir ilgi yolu için aşağı akış çalışmaları için kullanılabilir. Ek olarak, bu LSEC’ler ayrı ayrı havuzlanabilir veya kullanılabilir, RNA-seq kütlesi veya tek hücreli, proteomik veya fosfo-proteomik ve diğerlerinin yanı sıra dizileme (ATAC-seq) kullanarak Transpozaz-Erişilebilir Kromatin Testi dahil olmak üzere multi-omik veri üretimine izin verir. Bu protokol, LSEC’lerin sağlık ve hastalıktaki diğer karaciğer hücreleri ile iletişimini inceleyen araştırmacılar için yararlı olacak ve LSEC’lerin akut ve kronik karaciğer hasarının patojenik mekanizmalarındaki rolünün derinlemesine anlaşılmasını sağlayacaktır.
Introduction
Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC’ler) hepatik sinüzoid duvarları kaplar ve karaciğerde en bol bulunan parankimal olmayan hücrelerdir1. LSEC’ler, vücudun başka yerlerindeki diğer kılcal endotel hücrelerinden fenestra varlığı ve klasik bir bazal membran veya diyaframeksikliği ile ayırt edilir 2,3. Bu nedenle, LSEC’ler, lipitler ve lipoproteinler de dahil olmak üzere çeşitli dolaşımdaki makromolekülleri ortadan kaldırmak için geçirgenliklerini ve endositik kapasitelerini artıran ayırt edici fenotipik ve yapısal özelliklere sahiptir. LSEC’ler, yıldız hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi parankimal ve parankimal olmayan hücreler arasındaki çapraz konuşmada çok önemli bir rol oynar. LSEC’ler, yıldız hücrelerini ve Kupffer hücrelerini sessiz bir durumda tutarak karaciğer homeostazını korumada anahtardır4. LSEC’ler, dolaşımdaki lökositlerin adezyona ve transendotel göçüne aracılık ederek hepatik immün hücre popülasyonlarının bileşimini modüle eder 5,6. İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI)8, alkolsüz steatohepatit (NASH)9 ve hepatosellüler karsinom (HCC) dahil olmak üzere akut ve kronik karaciğer hasarı7 sırasında, LSEC’ler defenestrasyon ve bazal membran oluşumu ile karakterize kapillarizasyon olarak bilinen fenotipik değişikliklere uğrar10. LSEC’lerdeki bu fenotipik değişiklikler, LSEC’lerin disfonksiyonu ve protrombotik, proenflamatuar ve profibrojenik özelliklerin kazanılması ile ilişkilidir.
LSEC’lerin fare karaciğerinden izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir11. Bazı teknikler, parankimal olmayan ve parankimal hücrelerin ayrılmasına ve ardından LSEC’leri parankimal olmayan fraksiyonlardan arındırmak için yoğunluk gradyanı santrifüjlenmesine bağlıdır. Bu yöntemin sınırlaması, LSEC’lerin izolasyonunun son adımlarında kirletici makrofajların varlığıdır ve bu da izole edilmiş LSEC’lerin saflığını etkileyebilir12. Bu protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC’leri saflaştırmak için CD146 + manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu yöntem kullanılarak izole edilen LSEC’ler yüksek saflık ve korunmuş morfoloji ve canlılık gösterir. Bu LSEC’ler, geçirgenlik ve adezyon testi de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra ilgilenilen yollar için aşağı akış çalışmaları için de optimumdur. Dahası, hem klinik araştırma hem de keşif biliminde büyük veri kümeleri oluşturmaya olan ilginin artmasıyla birlikte, alkolsüz steatohepatit (NASH) veya diğer koşullara sahip hem sağlıklı hem de hastalıklı karaciğerlerden izole edilen bu yüksek kaliteli LSEC’ler, çoklu omik veri üretimine ve sağlık ile hastalık arasında karşılaştırmaya izin vererek ayrı ayrı toplanabilir veyakullanılabilir13,14 . Ek olarak, izole LSEC’ler, LSEC’lerdeki aktif sinyal yolunu ve farklı zararlı uyaranlar altında ve çeşitli terapötik müdahalelere yanıt olarak diğer karaciğer hücreleriyle hücresel iletişimlerini deşifre etmek için organoidler gibi iki boyutlu ve üç boyutlu in vitro modeller geliştirmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, iki aşamalı kollajenaz perfüzyonu ve ardından manyetik aktive hücre sıralamadan (MACS) oluşan fare karaciğerinden LSEC izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol aşağıdaki üç adımdan oluşur: (1) Karaciğer hücresi dispersiyonunu sağlamak için kalsiyum içermeyen bir tampon ile PV yoluyla perfüzyon ve ardından kollajenaz içeren bir tampon; (2) Düşük hızlı santrifüjleme ile hepatositlerin dışlanması; ve (3) anti-CD146 manyetik boncuklar kullanarak parankimal olm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIH Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (1RO1DK122948’den SHI’ye) ve NIH Silvio O. Conte Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezleri P30 hibe mekanizması (DK084567) tarafından desteklenmiştir. Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) Denizaşırı Araştırma Bursu tarafından KF’ye de destek sağlandı. Ayrıca Dr. Gregory J. Gores ve Steven Bronk’a kollajenaz perfüzyon aparatının orijinal tasarımı ve optimizasyonu için teşekkür ederiz.
Materials
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells – gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
