Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC’leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.
Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC’ler), dolaşım ve karaciğer parankimi arasındaki arayüzde yer alan özelleşmiş endotel hücreleridir. LSEC’ler, fenestra varlığı ve bazal membranın yokluğu ile karakterize edilen farklı bir morfolojiye sahiptir. LSEC’ler, metabolik disregülasyon, inflamasyon, fibroz, anjiyogenez ve karsinogenez dahil olmak üzere karaciğerdeki birçok patolojik bozuklukta önemli rol oynamaktadır. Bununla birlikte, LSEC’lerin izolasyonu ve karakterizasyonu hakkında çok az şey yayınlanmıştır. Burada, bu protokol LSEC’in hem sağlıklı hem de alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) farelerinden izolasyonunu tartışmaktadır. Protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC’leri saflaştırmak için manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu çalışma, akış sitometrisi ile spesifik belirteçler kullanarak LSEC’leri karakterize eder ve elektron mikroskobu taraması ile karakteristik fenotipik özellikleri tanımlar. Bu protokolü takiben izole edilen LSEC’ler, yapışma ve geçirgenlik testleri de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra belirli bir ilgi yolu için aşağı akış çalışmaları için kullanılabilir. Ek olarak, bu LSEC’ler ayrı ayrı havuzlanabilir veya kullanılabilir, RNA-seq kütlesi veya tek hücreli, proteomik veya fosfo-proteomik ve diğerlerinin yanı sıra dizileme (ATAC-seq) kullanarak Transpozaz-Erişilebilir Kromatin Testi dahil olmak üzere multi-omik veri üretimine izin verir. Bu protokol, LSEC’lerin sağlık ve hastalıktaki diğer karaciğer hücreleri ile iletişimini inceleyen araştırmacılar için yararlı olacak ve LSEC’lerin akut ve kronik karaciğer hasarının patojenik mekanizmalarındaki rolünün derinlemesine anlaşılmasını sağlayacaktır.
Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC’ler) hepatik sinüzoid duvarları kaplar ve karaciğerde en bol bulunan parankimal olmayan hücrelerdir1. LSEC’ler, vücudun başka yerlerindeki diğer kılcal endotel hücrelerinden fenestra varlığı ve klasik bir bazal membran veya diyaframeksikliği ile ayırt edilir 2,3. Bu nedenle, LSEC’ler, lipitler ve lipoproteinler de dahil olmak üzere çeşitli dolaşımdaki makromolekülleri ortadan kaldırmak için geçirgenliklerini ve endositik kapasitelerini artıran ayırt edici fenotipik ve yapısal özelliklere sahiptir. LSEC’ler, yıldız hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi parankimal ve parankimal olmayan hücreler arasındaki çapraz konuşmada çok önemli bir rol oynar. LSEC’ler, yıldız hücrelerini ve Kupffer hücrelerini sessiz bir durumda tutarak karaciğer homeostazını korumada anahtardır4. LSEC’ler, dolaşımdaki lökositlerin adezyona ve transendotel göçüne aracılık ederek hepatik immün hücre popülasyonlarının bileşimini modüle eder 5,6. İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI)8, alkolsüz steatohepatit (NASH)9 ve hepatosellüler karsinom (HCC) dahil olmak üzere akut ve kronik karaciğer hasarı7 sırasında, LSEC’ler defenestrasyon ve bazal membran oluşumu ile karakterize kapillarizasyon olarak bilinen fenotipik değişikliklere uğrar10. LSEC’lerdeki bu fenotipik değişiklikler, LSEC’lerin disfonksiyonu ve protrombotik, proenflamatuar ve profibrojenik özelliklerin kazanılması ile ilişkilidir.
LSEC’lerin fare karaciğerinden izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir11. Bazı teknikler, parankimal olmayan ve parankimal hücrelerin ayrılmasına ve ardından LSEC’leri parankimal olmayan fraksiyonlardan arındırmak için yoğunluk gradyanı santrifüjlenmesine bağlıdır. Bu yöntemin sınırlaması, LSEC’lerin izolasyonunun son adımlarında kirletici makrofajların varlığıdır ve bu da izole edilmiş LSEC’lerin saflığını etkileyebilir12. Bu protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC’leri saflaştırmak için CD146 + manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu yöntem kullanılarak izole edilen LSEC’ler yüksek saflık ve korunmuş morfoloji ve canlılık gösterir. Bu LSEC’ler, geçirgenlik ve adezyon testi de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra ilgilenilen yollar için aşağı akış çalışmaları için de optimumdur. Dahası, hem klinik araştırma hem de keşif biliminde büyük veri kümeleri oluşturmaya olan ilginin artmasıyla birlikte, alkolsüz steatohepatit (NASH) veya diğer koşullara sahip hem sağlıklı hem de hastalıklı karaciğerlerden izole edilen bu yüksek kaliteli LSEC’ler, çoklu omik veri üretimine ve sağlık ile hastalık arasında karşılaştırmaya izin vererek ayrı ayrı toplanabilir veyakullanılabilir13,14 . Ek olarak, izole LSEC’ler, LSEC’lerdeki aktif sinyal yolunu ve farklı zararlı uyaranlar altında ve çeşitli terapötik müdahalelere yanıt olarak diğer karaciğer hücreleriyle hücresel iletişimlerini deşifre etmek için organoidler gibi iki boyutlu ve üç boyutlu in vitro modeller geliştirmek için kullanılabilir.
Bu makalede, iki aşamalı kollajenaz perfüzyonu ve ardından manyetik aktive hücre sıralamadan (MACS) oluşan fare karaciğerinden LSEC izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol aşağıdaki üç adımdan oluşur: (1) Karaciğer hücresi dispersiyonunu sağlamak için kalsiyum içermeyen bir tampon ile PV yoluyla perfüzyon ve ardından kollajenaz içeren bir tampon; (2) Düşük hızlı santrifüjleme ile hepatositlerin dışlanması; ve (3) anti-CD146 manyetik boncuklar kullanarak parankimal olm…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, NIH Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (1RO1DK122948’den SHI’ye) ve NIH Silvio O. Conte Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezleri P30 hibe mekanizması (DK084567) tarafından desteklenmiştir. Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) Denizaşırı Araştırma Bursu tarafından KF’ye de destek sağlandı. Ayrıca Dr. Gregory J. Gores ve Steven Bronk’a kollajenaz perfüzyon aparatının orijinal tasarımı ve optimizasyonu için teşekkür ederiz.
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |