マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

Summary

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。

Abstract

肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、循環と肝実質との界面に位置する特殊な内皮細胞である。LSECは、フェネストラの存在および基底膜の欠如を特徴とする明確な形態を有する。LSECは、代謝調節不全、炎症、線維症、血管新生、および発癌を含む肝臓における多くの病理学的障害において不可欠な役割を果たす。しかし、LSECの単離と特性評価についてはほとんど発表されていない。ここで、このプロトコルは、健常および非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)マウスの両方からのLSECの単離について論じる。プロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓および非実質細胞の磁気ビーズ陽性選択のコラゲナーゼ灌流に基づいている。本研究では、フローサイトメトリーによる特異的マーカーを用いてLSECを特徴付け、走査型電子顕微鏡により特徴的な表現型の特徴を同定する。このプロトコールに従って単離されたLSECは、接着および透過性アッセイを含む機能的研究、ならびに関心のある特定の経路についての下流研究に使用することができる。さらに、これらのLSECは個別にプールまたは使用することができ、RNA-seqバルクまたは単一細胞、プロテオミクスまたはホスホプロテオミクス、およびシーケンシング(ATAC-seq)を使用したトランスポザーゼアクセシブルクロマチンのアッセイなどのマルチオミクスデータ生成を可能にします。このプロトコルは、健康および疾患におけるLSECと他の肝細胞とのコミュニケーションを研究する研究者にとって有用であり、急性および慢性肝障害の病原性メカニズムにおけるLSECの役割の詳細な理解を可能にする。

Introduction

肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、肝正弦波壁に並び、肝臓¹の中で最も豊富な非実質細胞である。LSECは、フェネストラの存在および古典的な基底膜または隔膜の欠如によって、体内の他の場所にある他の毛細血管内皮細胞と区別される^2,3。したがって、LSECは、脂質およびリポタンパク質を含む様々な循環巨大分子を排除する透過性およびエンドサイトーシス能力を高める独特の表現型および構造特性を有する。LSECは、星状細胞や免疫細胞などの実質細胞と非実質細胞のクロストークにおいて極めて重要な役割を果たしています。LSECは、星状細胞およびクッパー細胞を静止状態に保つことによって肝臓恒常性を維持する上で重要である⁴。LSECsは、循環白血球の接着および経内皮遊走を媒介することによって肝免疫細胞集団の組成を調節する^5,6。虚血再灌流傷害(IRI)⁸、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)⁹、および肝細胞癌(HCC)を含む急性および慢性肝障害⁷の間、LSECは毛細血管化として知られる表現型変化を受け、防御および基底膜¹⁰の形成を特徴とする。LSECにおけるこれらの表現型変化は、LSECの機能不全および血栓形成促進性、炎症促進性、および線維形成促進性の獲得と関連している。

マウス肝臓からLSECを単離するためのいくつかの方法が開発されている¹¹。いくつかの技術は、非実質細胞および実質細胞を分離し、続いて密度勾配遠心分離を行い、LSECを非実質画分から精製することに依存する。この方法の限界は、LSECs単離の最終ステップにおける汚染性マクロファージの存在であり、これは単離された^LSECs12の純度に影響を与え得る。このプロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓およびCD146⁺磁気ビーズ陽性の非実質細胞のコラゲナーゼ灌流に基づいている。この方法を用いて単離されたLSECは、高純度で保存された形態および生存率を示す。これらのLSECは、透過性および接着アッセイを含む機能研究、ならびに関心のある経路の下流研究に最適です。さらに、臨床研究と発見科学の両方で大きなデータセットを生成することへの関心の高まりに伴い、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または他の状態の健康な肝臓と病気の両方の肝臓から分離されたこれらの高品質のLSECを個別にプールまたは使用することができ、マルチオミクスデータ生成と健康と病気の比較が可能になります^13,14.さらに、単離されたLSECは、LSECにおける活性化されたシグナル伝達経路および異なる有害刺激下で、および様々な治療介入に応答して他の肝細胞との細胞間通信を解読するために、オルガノイドのような2次元および3次元のインビトロモデルを開発するために使用することができる。

Protocol

動物のプロトコルは、メイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたとおりに実施されました。8週齢のC57BL/6J雄マウスをジャクソン研究所から購入した。マウスを、食事への自由なアクセスを有する温度制御された12:12-h明暗サイクル施設に飼育した。 コラーゲンコート培養皿またはプレートの調製 50 mL の 0.02 mol/L 酢?…

Representative Results

実験回路図と装置のセットアップ:このプロトコールでは、マウス肝臓を閉鎖灌流回路を用いて消化し、次いで、非実質細胞および肝細胞を、50 x g で2分間の低速遠心分離によって分離した。一次LSECは、非実質画分からのCD146磁気ビーズ選択を用いて単離した。実験模式を 図1Aに示す。カニューレをPVを通して配置し、下大静脈を縛り付けて、肝臓?…

Discussion

現在の原稿では、2段階のコラゲナーゼ灌流とそれに続く磁気活性化細胞選別(MACS)からなるマウス肝臓からのLSEC単離のためのプロトコルを記述している。このプロトコルは、以下の3つのステップからなる:(1)PVをカルシウムを含まない緩衝液で灌流し、続いてコラゲナーゼ含有緩衝液を用いて肝細胞分散を達成する。(2)低速遠心分離による肝細胞の排除;(3)抗CD146磁気ビーズを用いた非実質細胞(…

Materials

2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07