Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l’isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.
Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) sono cellule endoteliali specializzate situate all’interfaccia tra la circolazione e il parenchima epatico. Le LSEC hanno una morfologia distinta caratterizzata dalla presenza di fenestrae e dall’assenza di membrana basale. Le LSEC svolgono un ruolo essenziale in molti disturbi patologici del fegato, tra cui la disregolazione metabolica, l’infiammazione, la fibrosi, l’angiogenesi e la carcinogenesi. Tuttavia, poco è stato pubblicato sull’isolamento e la caratterizzazione delle LSEC. Qui, questo protocollo discute l’isolamento di LSEC da topi sani e non alcolici di steatosi epatica (NAFLD). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di perline magnetiche di cellule non parenchimali per purificare le LSECs. Questo studio caratterizza le LSEC utilizzando marcatori specifici mediante citometria a flusso e identifica le caratteristiche fenotipiche caratteristiche mediante microscopia elettronica a scansione. Le LSEC isolate seguendo questo protocollo possono essere utilizzate per studi funzionali, compresi saggi di adesione e permeabilità, nonché studi a valle per una particolare via di interesse. Inoltre, questi LSEC possono essere raggruppati o utilizzati singolarmente, consentendo la generazione di dati multi-omica tra cui RNA-seq bulk o singola cellula, proteomica o fosfo-proteomica e Assay for Transposase-Accessible Chromatin utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), tra gli altri. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che studiano la comunicazione delle LSEC con altre cellule epatiche in salute e malattia e consentirà una comprensione approfondita del ruolo delle LSEC nei meccanismi patogenetici del danno epatico acuto e cronico.
Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) rivestono le pareti sinusoidi epatiche e sono le cellule non parenchimali più abbondanti nel fegato1. Le LSEC si distinguono dalle altre cellule endoteliali capillari in altre parti del corpo per la presenza di fenestrae e la mancanza di una membrana basale classica o di un diaframma 2,3. Quindi, le LSEC possiedono caratteristiche fenotipiche e strutturali distintive che migliorano la loro permeabilità e capacità endocitica di eliminare una varietà di macromolecole circolanti, inclusi lipidi e lipoproteine. Le LSEC svolgono un ruolo fondamentale nella diafonia tra cellule parenchimali e non parenchimali, come le cellule stellate e le cellule immunitarie. Le LSEC sono fondamentali per mantenere l’omeostasi epatica mantenendo le cellule stellate e le cellule di Kupffer in uno stato quiescente4. Le LSECs modulano la composizione delle popolazioni di cellule immunitarie epatiche mediando l’adesione e la migrazione trans-endoteliale dei leucociti circolanti 5,6. Durante il dannoepatico acuto e cronico 7, tra cui il danno da ischemia-riperfusione (IRI)8, la steatoepatite non alcolica (NASH)9 e il carcinoma epatocellulare (HCC), le LSECs subiscono cambiamenti fenotipici noti come capillarizzazione caratterizzati da defenestrazione e formazione della membrana basale10. Questi cambiamenti fenotipici nelle LSEC sono associati alla disfunzione delle LSECs e all’acquisizione di proprietà protrombotiche, proinfiammatorie e profibrogeniche.
Sono stati sviluppati diversi metodi per l’isolamento delle LSEC dal fegato di topo11. Alcune tecniche dipendono dalla separazione delle cellule non parenchimali e parenchimali seguita dalla centrifugazione a gradiente di densità per purificare le LSEC dalle frazioni non parenchimali. Il limite di questo metodo è la presenza di macrofagi contaminanti nelle fasi finali dell’isolamento delle LSECs, che potrebbero influenzare la purezza delle LSECsisolate 12. Questo protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di cellule non parenchimali CD146+ magnetiche per purificare le LSECs. Le LSEC isolate con questo metodo mostrano un’elevata purezza e morfologia e vitalità preservate. Questi LSEC sono ottimali per studi funzionali, compresi i test di permeabilità e adesione, nonché studi a valle per i percorsi di interesse. Inoltre, con il crescente interesse nel generare grandi set di dati sia nella ricerca clinica che nella scienza della scoperta, questi LSEC di alta qualità isolati da fegati sani e malati con steatoepatite non alcolica (NASH) o altre condizioni possono essere raggruppati o utilizzati individualmente, consentendo la generazione di dati multi-omici e il confronto tra salute e malattia13,14 . Inoltre, le LSEC isolate possono essere impiegate per sviluppare modelli in vitro bidimensionali e tridimensionali come gli organoidi per decifrare la via di segnalazione attivata nelle LSEC e la loro comunicazione intercellulare con altre cellule epatiche sotto diversi stimoli nocivi e in risposta a vari interventi terapeutici.
Nel manoscritto attuale, descriviamo un protocollo per l’isolamento LSEC dal fegato di topo costituito dalla perfusione di collagenasi in due fasi e dalla successiva selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo protocollo consiste nei seguenti tre passaggi: (1) Perfusione attraverso il PV con un tampone privo di calcio seguito da un tampone contenente collagenasi per ottenere la dispersione delle cellule epatiche; (2) Esclusione degli epatociti con centrifugazione a bassa velocità; e (3) selezione positiva…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases del NIH (1RO1DK122948 to SHI) e dal NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Il supporto è stato fornito a KF anche dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Gregory J. Gores e Steven Bronk per il loro design originale e l’ottimizzazione dell’apparato di perfusione della collagenasi.
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |