Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Summary

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l’isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Abstract

Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) sono cellule endoteliali specializzate situate all’interfaccia tra la circolazione e il parenchima epatico. Le LSEC hanno una morfologia distinta caratterizzata dalla presenza di fenestrae e dall’assenza di membrana basale. Le LSEC svolgono un ruolo essenziale in molti disturbi patologici del fegato, tra cui la disregolazione metabolica, l’infiammazione, la fibrosi, l’angiogenesi e la carcinogenesi. Tuttavia, poco è stato pubblicato sull’isolamento e la caratterizzazione delle LSEC. Qui, questo protocollo discute l’isolamento di LSEC da topi sani e non alcolici di steatosi epatica (NAFLD). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di perline magnetiche di cellule non parenchimali per purificare le LSECs. Questo studio caratterizza le LSEC utilizzando marcatori specifici mediante citometria a flusso e identifica le caratteristiche fenotipiche caratteristiche mediante microscopia elettronica a scansione. Le LSEC isolate seguendo questo protocollo possono essere utilizzate per studi funzionali, compresi saggi di adesione e permeabilità, nonché studi a valle per una particolare via di interesse. Inoltre, questi LSEC possono essere raggruppati o utilizzati singolarmente, consentendo la generazione di dati multi-omica tra cui RNA-seq bulk o singola cellula, proteomica o fosfo-proteomica e Assay for Transposase-Accessible Chromatin utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), tra gli altri. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che studiano la comunicazione delle LSEC con altre cellule epatiche in salute e malattia e consentirà una comprensione approfondita del ruolo delle LSEC nei meccanismi patogenetici del danno epatico acuto e cronico.

Introduction

Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) rivestono le pareti sinusoidi epatiche e sono le cellule non parenchimali più abbondanti nel fegato¹. Le LSEC si distinguono dalle altre cellule endoteliali capillari in altre parti del corpo per la presenza di fenestrae e la mancanza di una membrana basale classica o di un diaframma ^2,3. Quindi, le LSEC possiedono caratteristiche fenotipiche e strutturali distintive che migliorano la loro permeabilità e capacità endocitica di eliminare una varietà di macromolecole circolanti, inclusi lipidi e lipoproteine. Le LSEC svolgono un ruolo fondamentale nella diafonia tra cellule parenchimali e non parenchimali, come le cellule stellate e le cellule immunitarie. Le LSEC sono fondamentali per mantenere l’omeostasi epatica mantenendo le cellule stellate e le cellule di Kupffer in uno stato quiescente⁴. Le LSECs modulano la composizione delle popolazioni di cellule immunitarie epatiche mediando l’adesione e la migrazione trans-endoteliale dei leucociti circolanti ^5,6. Durante il danno^epatico acuto e cronico 7, tra cui il danno da ischemia-riperfusione (IRI)⁸, la steatoepatite non alcolica (NASH)⁹ e il carcinoma epatocellulare (HCC), le LSECs subiscono cambiamenti fenotipici noti come capillarizzazione caratterizzati da defenestrazione e formazione della membrana basale¹⁰. Questi cambiamenti fenotipici nelle LSEC sono associati alla disfunzione delle LSECs e all’acquisizione di proprietà protrombotiche, proinfiammatorie e profibrogeniche.

Sono stati sviluppati diversi metodi per l’isolamento delle LSEC dal fegato di topo¹¹. Alcune tecniche dipendono dalla separazione delle cellule non parenchimali e parenchimali seguita dalla centrifugazione a gradiente di densità per purificare le LSEC dalle frazioni non parenchimali. Il limite di questo metodo è la presenza di macrofagi contaminanti nelle fasi finali dell’isolamento delle LSECs, che potrebbero influenzare la purezza delle LSECs^{isolate 12}. Questo protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di cellule non parenchimali CD146⁺ magnetiche per purificare le LSECs. Le LSEC isolate con questo metodo mostrano un’elevata purezza e morfologia e vitalità preservate. Questi LSEC sono ottimali per studi funzionali, compresi i test di permeabilità e adesione, nonché studi a valle per i percorsi di interesse. Inoltre, con il crescente interesse nel generare grandi set di dati sia nella ricerca clinica che nella scienza della scoperta, questi LSEC di alta qualità isolati da fegati sani e malati con steatoepatite non alcolica (NASH) o altre condizioni possono essere raggruppati o utilizzati individualmente, consentendo la generazione di dati multi-omici e il confronto tra salute e malattia^13,14 . Inoltre, le LSEC isolate possono essere impiegate per sviluppare modelli in vitro bidimensionali e tridimensionali come gli organoidi per decifrare la via di segnalazione attivata nelle LSEC e la loro comunicazione intercellulare con altre cellule epatiche sotto diversi stimoli nocivi e in risposta a vari interventi terapeutici.

Protocol

I protocolli sugli animali sono stati condotti come approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Mayo Clinic. I topi maschi C57BL / 6J di otto settimane sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. I topi sono stati alloggiati in una struttura a temperatura controllata 12: 12-h di ciclo chiaro-buio con libero accesso alla dieta. 1. Preparazione del piatto o del piatto di coltura rivestito di collagene Per produrre 50 mL di acido acetico 0…

Representative Results

Schemi sperimentali e messa a punto delle apparecchiature:In questo protocollo, il fegato di topo è stato digerito utilizzando un circuito di perfusione chiuso, quindi le cellule non parenchimali e gli epatociti sono stati separati mediante centrifugazione a bassa velocità a 50 x g per 2 minuti. Le LSEC primarie sono state isolate utilizzando la selezione di perline magnetiche CD146 dalla frazione non parenchimale. Gli schemi sperimentali sono mostrati nella Figura 1A<…

Discussion

Nel manoscritto attuale, descriviamo un protocollo per l’isolamento LSEC dal fegato di topo costituito dalla perfusione di collagenasi in due fasi e dalla successiva selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo protocollo consiste nei seguenti tre passaggi: (1) Perfusione attraverso il PV con un tampone privo di calcio seguito da un tampone contenente collagenasi per ottenere la dispersione delle cellule epatiche; (2) Esclusione degli epatociti con centrifugazione a bassa velocità; e (3) selezione positiva…

Materials

2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter	Terumo, SOmerset, NJ, USA	SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center			customized; made in house
405/520 viability dye	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps	Fisher Brand	FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture	Ethicon, Raritan, NJ, USA	A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488	MBL International, Woburn, MA, USA	D317-A48
BSA stock	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-110-803
Collagen type I	Corning, Corning, NY, USA	354236
Collagenase II	Gibco, Waltham, MA, USA	17101-015
Endothelial cells growth medium	ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA	211-500
FcR blocking reagent, mouse	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
FlowJo software, version 10.6	Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi.			customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope	Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA	SEM096
LS columns	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-823
MACS rinsing buffer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm)	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany	130-098-462
MACSQunt flow cytometer	Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	PITP01250
Nexcelom cell counter	Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA	Cellometer Auto T4 Plus
Percoll	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	17-0891-01
Surgical scissors	F.S.T, Foster city, CA, USA	14001-12
Very small curved dressing forceps	F.S.T, Foster city, CA, USA	11063-07