Het huidige protocol beschrijft intratibia osteosarcoom celinjectie om muismodellen te genereren met orthotopisch osteosarcoom en pulmonale metastase laesies.
Osteosarcoom is de meest voorkomende primaire botkanker bij kinderen en adolescenten, met longen als de meest voorkomende gemetastaseerde plaats. De vijfjaarsoverleving van osteosarcoompatiënten met pulmonale metastase is minder dan 30%. Daarom is het gebruik van muismodellen die de ontwikkeling van osteosarcoom bij mensen nabootsen van groot belang voor het begrijpen van het fundamentele mechanisme van osteosarcoomcarcinogenese en pulmonale metastase om nieuwe therapieën te ontwikkelen. Hier worden gedetailleerde procedures gerapporteerd om de primaire osteosarcoom- en pulmonale metastasemuismodellen te genereren via intratibia-injectie van osteosarcoomcellen. In combinatie met het bioluminescentie- of röntgensysteem voor live beeldvorming, worden deze levende muismodellen gebruikt om de groei en metastase van osteosarcoom te monitoren en te kwantificeren. Om dit model vast te stellen, werd een keldermembraanmatrix met osteosarcoomcellen geladen in een microvolumespuit en geïnjecteerd in één scheenbeen van elke athymische muis na te zijn verdoofd. De muizen werden opgeofferd toen het primaire osteosarcoom de groottebeperking in het door de IACUC goedgekeurde protocol bereikte. De benen met osteosarcoom en de longen met uitzaaiingen werden gescheiden. Deze modellen worden gekenmerkt door een korte incubatietijd, snelle groei, ernstige laesies en gevoeligheid bij het monitoren van de ontwikkeling van primaire en pulmonale gemetastaseerde laesies. Daarom zijn dit ideale modellen voor het verkennen van de functies en mechanismen van specifieke factoren in osteosarcoom carcinogenese en pulmonale metastase, de tumormicro-omgeving en het evalueren van de therapeutische werkzaamheid in vivo.
Osteosarcoom is de meest voorkomende primaire botkanker bij kinderen en adolescenten 1,2, die voornamelijk het omliggende weefsel infiltreert en zelfs uitzaait naar de longen wanneer de patiënten worden gediagnosticeerd. Pulmonale metastase is de belangrijkste uitdaging voor osteosarcoomtherapie en de vijfjaarsoverleving van osteosarcoompatiënten met pulmonale metastase blijft zo laag als 20% -30% 3,4,5. De vijfjaarsoverleving van primair osteosarcoom is echter sinds de jaren 1970 verhoogd tot ongeveer 70% als gevolg van de introductie van chemotherapie6. Daarom is het dringend nodig om het fundamentele mechanisme van osteosarcoomcarcinogenese en pulmonale metastase te begrijpen om nieuwe therapieën te ontwikkelen. De toepassing van muismodellen die de progressie van osteosarcoom bij mensen het beste nabootsen, is van groot belang7.
De osteosarcoom diermodellen worden gegenereerd door spontane, geïnduceerde genetische manipulatie, transplantatie en andere technieken. Het spontane osteosarcoommodel wordt zelden gebruikt vanwege de lange tumorvormingstijd, inconsistente tumorvoorval, lage morbiditeit en slechte stabiliteit 8,9. Hoewel het geïnduceerde osteosarcoommodel toegankelijker is om te verkrijgen dan het spontane osteosarcoom, is de toepassing van het geïnduceerde osteosarcoommodel beperkt omdat de inducerende factor de micro-omgeving, de pathogenese en pathologische kenmerken van osteosarcoom zal beïnvloeden10. Transgene modellen helpen de pathogenese van kankers te begrijpen, omdat ze de menselijke fysiologische en pathologische omgevingen beter kunnen simuleren; de transgene diermodellen hebben echter ook hun beperkingen vanwege de moeilijkheid, lange termijn en hoge kosten van transgene modificatie. Bovendien, zelfs in de meest algemeen aanvaarde transgene diermodellen gegenereerd door p53- en Rb-genmodificatie, kwam slechts 13,6% van het sarcoom voor in de botten van de vier ledematen11,12.
Transplantatie is een van de meest gebruikte primaire en verre gemetastaseerde kankermodelproductiemethoden in de afgelopen jaren vanwege de eenvoudige manoeuvre, stabiele tumorvormingssnelheid en betere homogeniteit13. Transplantatie omvat heterotope transplantatie en orthotopische transplantatie volgens de transplantatieplaatsen. Bij osteosarcoom heterotope transplantatie worden de osteosarcoomcellen geïnjecteerd buiten de primaire osteosarcoomplaatsen (bot) van de dieren, meestal onder de huid, subcutaan14. Hoewel de heterotope transplantatie eenvoudig is zonder de noodzaak om een operatie bij dieren uit te voeren, vertegenwoordigen de plaatsen waar de osteosarcoomcellen worden geïnjecteerd niet de werkelijke menselijke osteosarcoommicro-omgeving. Osteosarcoom orthotopische transplantatie is wanneer de osteosarcoomcellen worden geïnjecteerd in de botten van dieren, zoals tibia15,16. In vergelijking met de heterotope grafts worden orthotopische osteosarcoomtransplantaten gekenmerkt door een korte incubatietijd, snelle groei en een sterke erosieve aard; daarom zijn het ideale diermodellen voor osteosarcoom-gerelateerde studies17.
De meest gebruikte dieren zijn muizen, honden en zebravissen18,19. Het spontane model van osteosarcoom wordt meestal gebruikt bij honden omdat osteosarcoom een van de meest voorkomende tumoren bij honden is. De toepassing van dit model is echter beperkt vanwege de lange tumorvormingstijd, de lage tumorigenesesnelheid, slechte homogeniteit en stabiliteit. Zebravissen worden vaak gebruikt om transgene of knock-out tumormodellen te construeren vanwege hun snelle reproductie20. Maar zebravisgenen verschillen van menselijke genen, dus hun toepassingen zijn beperkt.
Dit werk beschrijft de gedetailleerde procedures, voorzorgsmaatregelen en representatieve beelden voor het produceren van het primaire osteosarcoom in het scheenbeen met pulmonale metastase via intratibia-injectie van osteosarcoomcellen in athymische muizen. Deze methode werd toegepast om het primaire osteosarcoom in het tibia van muizen te creëren voor therapeutische werkzaamheidsevaluatie, die een hoge reproduceerbaarheid vertoonde21,22.
Orthotopische injectie van osteosarcoomcellen is een ideaal model om de functie en het mechanisme van specifieke factoren in osteosarcoomcarcinogenese en ontwikkeling te bestuderen om de therapeutische werkzaamheid te evalueren. Om verschillen in tumorgroei te voorkomen, worden de meeste actieve osteosarcoomcellen bij 80% -90% confluent met hetzelfde aantal zorgvuldig geïnjecteerd in het scheenbeen van elke muis en wordt de cel trypsinisatietijd strikt gecontroleerd zonder de levensvatbaarheid van de cel te beïnvloeden…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door subsidies van (1) National Key R & D Program of China (2018YFC1704300 en 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 en 82174408).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |