Intratibiale Osteosarkom-Zellinjektion zur Erzeugung orthotoper Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Intratibia-Osteosarkom-Zellinjektion zur Generierung von Mausmodellen mit orthotopen Osteosarkom- und Lungenmetastasenläsionen.
Abstract
Das Osteosarkom ist der häufigste primäre Knochenkrebs bei Kindern und Jugendlichen, wobei die Lunge die häufigste metastasierende Stelle ist. Die Fünf-Jahres-Überlebensrate von Osteosarkom-Patienten mit Lungenmetastasen beträgt weniger als 30%. Daher ist die Verwendung von Mausmodellen, die die Osteosarkomentwicklung beim Menschen nachahmen, von großer Bedeutung für das Verständnis des grundlegenden Mechanismus der Osteosarkomkarzinogenese und Lungenmetastasierung zur Entwicklung neuartiger Therapeutika. Hier werden detaillierte Verfahren berichtet, um die primären Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle über die Intratibia-Injektion von Osteosarkom-Zellen zu erzeugen. In Kombination mit dem Biolumineszenz- oder Röntgen-Live-Imaging-System werden diese lebenden Mausmodelle verwendet, um das Wachstum und die Metastasierung von Osteosarkomen zu überwachen und zu quantifizieren. Um dieses Modell zu etablieren, wurde eine Basalmembranmatrix, die Osteosarkomzellen enthielt, in eine Mikrovolumenspritze geladen und nach der Anästhesie in eine Tibia jeder athymischen Maus injiziert. Die Mäuse wurden geopfert, als das primäre Osteosarkom die Größenbeschränkung im IACUC-genehmigten Protokoll erreichte. Die Beine mit Osteosarkom und die Lunge mit Metastasenläsionen wurden getrennt. Diese Modelle zeichnen sich durch eine kurze Inkubationszeit, schnelles Wachstum, schwere Läsionen und Empfindlichkeit bei der Überwachung der Entwicklung primärer und pulmonaler metastasierender Läsionen aus. Daher sind dies ideale Modelle, um die Funktionen und Mechanismen spezifischer Faktoren in der Osteosarkom-Karzinogenese und Lungenmetastasierung, der Tumormikroumgebung und der Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit in vivo zu untersuchen.
Introduction
Das Osteosarkom ist der häufigste primäre Knochenkrebs bei Kindern und Jugendlichen1,2, der hauptsächlich das umliegende Gewebe infiltriert und sogar in die Lunge metastasiert, wenn die Patienten diagnostiziert werden. Lungenmetastasen sind die größte Herausforderung für die Osteosarkom-Therapie, und die Fünf-Jahres-Überlebensrate von Osteosarkom-Patienten mit Lungenmetastasen bleibt so niedrig wie 20% -30% 3,4,5. Die Fünf-Jahres-Überlebensrate des primären Osteosarkoms ist jedoch seit den 1970er Jahren aufgrund der Einführung der Chemotherapie auf etwa 70% gestiegen6. Daher ist es dringend notwendig, den grundlegenden Mechanismus der Osteosarkom-Karzinogenese und Lungenmetastasierung zu verstehen, um neuartige Therapien zu entwickeln. Die Anwendung von Mausmodellen, die das Fortschreiten des Osteosarkoms beim Menschen am besten nachahmen, ist von großer Bedeutung7.
Die Osteosarkom-Tiermodelle werden durch spontane, induzierte Gentechnik, Transplantation und andere Techniken erzeugt. Das Modell des spontanen Osteosarkoms wird aufgrund der langen Tumorbildungszeit, der inkonsistenten Tumorauftretensrate, der geringen Morbidität und der schlechten Stabilität selten verwendet 8,9. Obwohl das induzierte Osteosarkommodell zugänglicher ist als das spontane Osteosarkom, ist die Anwendung des induzierten Osteosarkommodells begrenzt, da der induzierende Faktor die Mikroumgebung, die Pathogenese und die pathologischen Merkmale des Osteosarkoms10 beeinflusst. Transgene Modelle helfen, die Pathogenese von Krebs zu verstehen, da sie die physiologischen und pathologischen Umgebungen des Menschen besser simulieren können; Die transgenen Tiermodelle haben jedoch auch ihre Grenzen aufgrund der Schwierigkeit, der langfristigen und der hohen Kosten der transgenen Modifikation. Darüber hinaus traten selbst in den am weitesten verbreiteten transgenen Tiermodellen, die durch p53- und Rb-Genmodifikation erzeugt wurden, nur 13,6% des Sarkoms in den vier Gliedmaßenknochenauf 11,12.
Die Transplantation ist aufgrund ihres einfachen Manövers, der stabilen Tumorbildungsrate und der besseren Homogenität in den letzten Jahren eine der am häufigsten verwendeten primären und fernmetastasierenden Krebsmodell-produzierenden Methoden13. Die Transplantation umfasst die heterotope Transplantation und die orthotope Transplantation entsprechend den Transplantationsstellen. Bei der heterotopen Osteosarkomtransplantation werden die Osteosarkomzellen außerhalb der primären Osteosarkomstellen (Knochen) der Tiere, üblicherweise unter die Haut, subkutan14 injiziert. Obwohl die heterotope Transplantation unkompliziert ist, ohne dass eine Operation an Tieren durchgeführt werden muss, stellen die Stellen, an denen die Osteosarkomzellen injiziert werden, nicht die tatsächliche Mikroumgebung des menschlichen Osteosarkoms dar. Osteosarkom orthotope Transplantation ist, wenn die Osteosarkom-Zellen in die Knochen der Tiere, wie Tibia15,16, injiziert werden. Im Vergleich zu den heterotopen Transplantaten zeichnen sich orthotope Osteosarkomtransplantate durch eine kurze Inkubationszeit, schnelles Wachstum und starke erosive Natur aus; Daher sind sie ideale Tiermodelle für osteosarkombezogene Studien17.
Die am häufigsten verwendeten Tiere sind Mäuse, Hunde und Zebrafische18,19. Das spontane Modell des Osteosarkoms wird normalerweise bei Hunden verwendet, da das Osteosarkom einer der häufigsten Tumoren bei Hunden ist. Die Anwendung dieses Modells ist jedoch aufgrund der langen Tumorbildungszeit, der niedrigen Tumorentstehungsrate, der schlechten Homogenität und Stabilität begrenzt. Zebrafische werden aufgrund ihrer schnellen Reproduktion häufig zur Konstruktion transgener oder Knockout-Tumormodelleverwendet 20. Aber Zebrafischgene unterscheiden sich von menschlichen Genen, so dass ihre Anwendungen begrenzt sind.
Diese Arbeit beschreibt die detaillierten Verfahren, Vorsichtsmaßnahmen und repräsentativen Bilder zur Erzeugung des primären Osteosarkoms in der Tibia mit pulmonaler Metastasierung durch Intratibia-Injektion von Osteosarkom-Zellen in athymischen Mäusen. Diese Methode wurde angewendet, um das primäre Osteosarkom in Maus-Tibia für die therapeutische Wirksamkeitsbewertung zu erzeugen, die eine hohe Reproduzierbarkeitzeigte 21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die orthotope Injektion von Osteosarkomzellen ist ein ideales Modell, um die Funktion und den Mechanismus spezifischer Faktoren bei der Karzinogenese des Osteosarkoms zu untersuchen und die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten. Um Unterschiede im Tumorwachstum zu vermeiden, werden die meisten aktiven Osteosarkomzellen bei 80% -90% Konfluent mit der gleichen Anzahl vorsichtig in die Tibia jeder Maus injiziert, und die Zelltrypsinisierungszeit wird streng kontrolliert, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse von (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 und 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408) unterstützt.
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
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