繊毛拍動頻度の定量化のための初代ヒト鼻上皮細胞モデルの収集、拡大、および分化
Summary
このプロトコルでは、鼻上皮細胞の収集、拡張、器官型気道上皮細胞モデルへの分化、および生細胞イメージングとカスタムビルドスクリプトによる繊毛拍動頻度の定量化について説明します。
Abstract
繊毛機能(拍動頻度、パターン)の測定は、原発性毛様体ジスキネジアなどの呼吸器疾患の診断ツールとして確立されています。しかしながら、これらの技術のより広い適用は、温度、湿度、およびpHなどの環境要因の変化に対する繊毛機能の極端な感受性によって制限される。 嚢胞性線維症(CF)患者の気道では、粘液の蓄積が繊毛の拍動を妨げます。繊毛機能は、CF膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)チャネル活性の指標として、一次気道細胞モデルで調査されています。しかし、繊毛拍動頻度のかなりの患者間変動は、同じ CFTR 変異を有する患者であっても、CFTR調節薬に応答して見出されている。さらに、機能不全のCFTR調節された塩化物分泌が毛様体機能に与える影響はよくわかっていません。現在、 in vitro 気道モデルのサンプル調製、画像取得、および繊毛拍動周波数(CBF)の分析を実証する包括的なプロトコルはありません。標準化された培養条件と環境制御された条件下で実行される画像取得により、個人間およびCFTR調節薬に応答したCBFの一貫した再現性のある定量が可能になります。このプロトコルは、3つの異なる気道上皮細胞モデルシステムにおけるCBFの定量について説明しています:1)ネイティブ上皮シート、2)透過性サポートインサート上に画像化された気液界面モデル、および3)細胞外マトリックス埋め込み3次元オルガノイド。後者の2つは、繊毛の拍動と粘液の産生を伴う in vivo 肺生理学を再現します。毛様体は、環境制御されたチャンバー内で高速ビデオカメラを使用してキャプチャされます。カスタムビルドのスクリプトは、CBFの分析に使用されます。CBF測定値の臨床への翻訳は、患者ごとにCFTR調節薬に対する反応を予測するための重要な臨床ツールであることが想定されています。
Introduction
繊毛拍動頻度(CBF)とパターンの測定は、原発性毛様体ジスキネジア(PCD)1などの呼吸器疾患の診断ツールとして確立されています。嚢胞性線維症(CF)では、CF膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)塩化物チャネルの機能不全により、気道表面液の脱水と粘液繊毛クリアランスの障害を引き起こします2。繊毛機能は、CFTRチャネル活性の指標として一次気道細胞モデルで in vitro で調査されています3。しかし、CFTR調節薬に応答するCBFには、同じ CFTR 変異を有する患者であっても、かなりの患者間変動が存在する3。さらに、機能不全のCFTR調節された塩化物分泌が毛様体機能に与える影響はよくわかっていません。現在、 in vitro 気道モデルのサンプル調製、画像取得、およびCBFの分析を実証する包括的なプロトコルはありません。
鼻粘膜ブラッシングから分離された鼻上皮シートは、PCD診断の毛様体機能の測定に直接使用されます4。しかし、得られる鼻上皮シートのサイズや品質を制御することはできませんが、CBFは、単一細胞または細胞シート、および破壊された、または破壊されていない上皮シート繊毛縁で測定されるかどうかによって異なります5。そのため、鼻粘膜ブラッシングの収集中の細胞の損傷によって引き起こされる二次性ジスキネジアは、CBFに影響を与える可能性があります。鼻上皮細胞の初代細胞培養と、気液界面(ALI)または三次元基底膜マトリックスでの繊毛気道上皮オルガノイドへの分化は、二次ジスキネジアのない繊毛を生じさせます4,6,7,8。ALIで分化した気道上皮細胞(以下、ALIモデルと呼ぶ)は、毛様体拍動パターンとex vivo鼻粘膜ブラッシングの頻度を再現し、患者固有の欠陥を保持しながら毛様体微細構造、拍動パターン、および拍動頻度の分析を可能にする重要な二次診断補助と見なされています9。.しかし、これらの偽層状の粘液繊毛分化細胞モデルを作成するために使用される方法論には矛盾が存在します。異なる培養拡大または分化プロトコルは、明確な上皮表現型(繊毛または分泌)を誘導し10、CBF11に有意差をもたらす可能性があります。CBFは、鼻上皮ブラッシング4、6、12、13、14、15、16、気道上皮オルガノイド14、17、18およびALIモデル3、4、6、13、19、20において定量化されており、21.しかし、これらのプロトコルの中には大きなばらつきがあり、多くの場合、多くのパラメータが制御されていません。例えば、いくつかの研究では、ALIモデルの細胞が透過性支持体インサート3,19,20,21上に留まっている間にCBFがその場で画像化されるが、さらに他の研究は透過性支持体インサートから細胞を掻き取り、それらを培地4,6,13に懸濁して画像化する。
さらに、毛様体機能を測定する技術のより広い適用は、環境要因の変化に対する毛様体機能の極端な感受性によって制限されています。温度22、湿度23,24、pH25,26などの環境要因は毛様体機能に影響を与えるため、CBFを正確に定量化するには調整する必要があります。さまざまな実験室で使用されるさまざまな生理学的パラメーターと、それらがCBFにどのように影響するかは、以前にレビューされています27。
CBF測定に対する様々なイメージング技術およびアプローチが文献に報告されている。PCD診断では、ビデオ顕微鏡を使用して毛様体機能を測定します28,29。最近、示差動的顕微鏡に基づくビデオ分析アルゴリズムを使用して、気道上皮細胞ALIモデルにおけるCBFと繊毛の両方の協調を定量化しました3,30。この方法は、気道上皮細胞における毛様体拍動の特性評価を、領域をセグメント化または選択することなく、迅速かつ完全に自動化された方法で可能にする。CBFのイメージングおよび定量のための様々な方法は、文献中のCBFで報告されている違いに追加される可能性があります(補足ファイル1)。
既存のメソッドを合理化するための培養から定量、培養条件の標準化、および厳密な環境制御条件下で実行される画像取得までのプロトコルにより、個人内および個人間でのCBFの一貫した再現性のある定量が可能になります。
このプロトコルは、鼻起源の3つの異なる気道上皮細胞モデルシステムにおける上皮細胞の収集、増殖および分化培養条件、およびCBFの定量の完全な説明を提供します:1)ネイティブ上皮シート、2)透過性サポートインサートで画像化されたALIモデル、および3)細胞外マトリックス(ECM)埋め込み3次元オルガノイド(図1).鼻の下鼻甲介ブラッシングから得られた鼻上皮細胞は、気管支ブラッシングの収集に関連する侵襲的手順を克服しながら気管支上皮細胞31の有効な代理であるため、気道上皮の代表として使用される。条件付きリプログラミング細胞(CRC)法は、ALIモデルおよび3次元オルガノイドの作成のために初代気道上皮細胞を拡張するために使用されます。幹細胞様状態への気道上皮細胞の条件付きリプログラミングは、増殖停止線維芽細胞フィーダー細胞系およびRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤32との共培養によって誘導される。重要なことに、CRC法は、組織特異的な分化能を保持しながら、気道上皮細胞の集団倍増を増加させる33,34。すべての気道上皮細胞モデルにおいて、毛様体は、標準化された画像取得設定を備えた高速ビデオカメラを使用して、温度制御されたチャンバーでキャプチャされます。CBFの定量化には、カスタムビルドのスクリプトが使用されます。
図1:ワークフローの概略図。 参加者の鼻の下鼻甲介をブラッシングした後、気道上皮細胞は2つの方法のいずれかで利用されます。気道上皮シートを単離し、繊毛拍動頻度を直ちに画像化するか、または気道上皮細胞を条件付きリプログラミング細胞法で拡張します。CRC拡張気道上皮細胞は、気液界面または気道上皮オルガノイド培養で気道上皮細胞を確立するために分化されます。毛様体拍動周波数のイメージングは、加熱および湿度環境チャンバーと高速フレームレート(>100Hz)の科学用カメラを備えた生細胞イメージング顕微鏡を使用して取得されます。データ分析は、カスタムビルドのスクリプトを使用して実行されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
鼻上皮シート中のCBFの定量を不明瞭にする可能性のある複数の要因があります。上皮シートは、毛様体機能がこの時間の間に最も安定しているため、サンプル収集から3〜9時間以内に画像化する必要があります37。赤血球や破片が少ないと、データ収集が妨げられるため、イメージングに最適です。イメージングのROIを選択する場合、これらの変数がCBF5に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究参加者とその家族の貢献に感謝します。シドニー小児病院(SCH)ランドウィック呼吸器科からの患者の生体標本の整理と収集の支援に感謝します-ジョン・ウィジャー博士、イボンヌ・ベレッシス博士、リアン・プラッシュ、アマンダ・トンプソン、ロンダ・ベルに感謝します。私たちは、UNSWシドニーのマークウェインライト分析センター内のカタリーナガウス光学顕微鏡施設のイヴェタスラペトワとレニーワンの支援に感謝します。この作業は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)(GNT1188987)、CF財団オーストラリア、シドニー小児病院財団の支援を受けています。著者らは、ルミネスアライアンス-子供の健康のためのイノベーションの貢献と支援に感謝したいと思います。Luminesce Alliance – Innovation for Children’s Healthは、Sydney Children’s Hospitals Network、Children’s Medical Research Institute、Children’s Cancer Instituteの非営利共同事業です。小児科研究を調整および統合するために、ニューサウスウェールズ州政府の支援を受けて設立されました。ルミネッセアライアンスは、シドニー大学とニューサウスウェールズ大学シドニー校とも提携しています。KMAは、オーストラリア政府の研究トレーニングプログラム奨学金によってサポートされています。LKFは、シドニーコーブ・ロータリークラブ/シドニー小児病院財団とUNSW大学大学院賞奨学金の支援を受けています。
Materials
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
| Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
| Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
| Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
| Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
| MATLAB | MathWorks | Computing software | |
| Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
| NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
| PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
| rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
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