Isolamento, Propagação e Identificação de Espécies Bacterianas com Propriedades Metabolizadoras de Hidrocarbonetos de Habitats Aquáticos
Summary
Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.
Abstract
Os hidrocarbonetos poluentes são recalcitrantes à degradação e seu acúmulo no meio ambiente é tóxico para todas as formas de vida. As bactérias codificam numerosas enzimas catalíticas e são naturalmente capazes de metabolizar hidrocarbonetos. Os cientistas aproveitam a biodiversidade nos ecossistemas aquáticos para isolar bactérias com potencial de biodegradação e biorremediação. Tais isolados do ambiente fornecem um rico conjunto de vias metabólicas e enzimas, que podem ser posteriormente utilizadas para escalar o processo de degradação em escala industrial. Neste artigo, descrevemos o processo geral de isolamento, propagação e identificação de espécies bacterianas de habitats aquáticos e selecionamos sua capacidade de utilizar hidrocarbonetos como única fonte de carbono in vitro usando técnicas simples. O presente protocolo descreve o isolamento de várias espécies bacterianas e sua posterior identificação utilizando a análise do 16S rRNA. O protocolo também apresenta etapas para a caracterização do potencial degradador de hidrocarbonetos de isolados bacterianos. Este protocolo será útil para pesquisadores que tentam isolar espécies bacterianas de habitats ambientais para suas aplicações biotecnológicas.
Introduction
Os hidrocarbonetos (HC) são amplamente utilizados tanto como combustíveis quanto em aplicações químicas. Hidrocarbonetos aromáticos como benzeno, tolueno e xileno são amplamente utilizados como solventes1. Alcenos como etileno e propileno servem como precursores na síntese de polímeros de polietileno e polipropileno, respectivamente. Polimerização de outro hidrocarboneto, estireno forma poliestireno. As atividades antrópicas introduzem hidrocarbonetos no meio ambiente durante sua produção e transporte. A contaminação do solo e da água por hidrocarbonetos preocupa seriamente o ambiente e a saúde humana. Os micróbios desempenham um papel importante na manutenção do ecossistema, regulando os ciclos biogeoquímicos e utilizando uma ampla gama de substratos, que incluem poluentes e xenobióticos também, convertendo-os em carbono e fonte de energia. Esse processo de desintoxicação de contaminantes ambientais por microrganismos é conhecido como biorremediação 3,4,5,6,7.
Microrganismos com capacidade de degradar hidrocarbonetos são encontrados em habitats aquáticos e de solo 8,9,10. Muitas bactérias com potencial para degradar alcanos e HCs aromáticos têm sido identificadas, como Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter11. O desenvolvimento de abordagens tecnologicamente avançadas independentes de cultura tem ajudado a descobrir novas comunidades microbianas degradadoras de HC12. O material genômico isolado diretamente das amostras de origem é amplificado e sequenciado por métodos de alto rendimento, como o Next Generation Sequencing (NGS), seguido de análise, eliminando a necessidade de cultivar microrganismos. Métodos de NGS, como a análise do metagenoma, são caros e sofrem de inconvenientes relacionados ao processo deamplificação13. Técnicas de cultivo como a cultura de enriquecimento seletivo14 que visam o isolamento de micróbios degradadores de hidrocarbonetos ainda são úteis, pois permitem aos pesquisadores sondar e manipular vias metabólicas em isolados bacterianos.
O isolamento do DNA genômico e o subsequente sequenciamento do material genômico revelam informações valiosas sobre qualquer organismo. O sequenciamento do genoma completo auxilia na identificação de genes que codificam resistência a antibióticos, potenciais alvos de drogas, fatores de virulência, transportadores, enzimas metabolizadoras de xenobióticos, etc15,16,17. O sequenciamento do gene codificador do 16SrRNA provou ser uma técnica robusta para identificar a filogenia bacteriana. A conservação da sequência e função do gene ao longo dos anos o torna uma ferramenta confiável para identificar bactérias desconhecidas e comparar um isolado com a espécie mais próxima. Além disso, o comprimento desse gene é ótimo para análise de bioinformática18. Todas essas características, juntamente com a facilidade de amplificação de genes usando primers universais e o aprimoramento na tecnologia de sequenciamento gênico, fazem dele um padrão ouro para a identificação de micróbios.
Neste trabalho, descrevemos um procedimento para recuperação de microrganismos cultiváveis com potencial degradador de HC a partir de amostras ambientais. O método descrito a seguir descreve a coleta e identificação de bactérias degradadoras de HC e é dividido em cinco seções: (1) coleta de bactérias de amostras de água, (2) isolamento de culturas puras, (3) exploração da capacidade degradadora de HC de isolados bacterianos, (4) isolamento de DNA genômico e (5) identificação baseada em sequenciamento do gene 16S rRNA e análise BLAST. Este procedimento pode ser adaptado para isolar bactérias para as mais diversas aplicações biotecnológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Está bem estabelecido que apenas aproximadamente 1% das bactérias na Terra pode ser facilmente cultivada em laboratório6. Mesmo entre as bactérias cultiváveis, muitas permanecem descaracterizadas. Melhorias nos métodos moleculares deram uma nova dimensão à análise e avaliação das comunidades bacterianas. No entanto, tais técnicas apresentam limitações, mas não tornam redundantes as análises de cultura. Técnicas de cultivo puro para isolar espécies bacterianas individuais permanec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Karthik Krishnan e aos membros do laboratório RP por seus comentários e sugestões úteis. O DS é apoiado pela SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. O laboratório RP é apoiado por uma bolsa CSIR-EMR e fundos de start-up da Universidade Shiv Nadar.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
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