Summary
אנו מציגים את תהליך הבידוד, ההתרבות והאפיון של חיידקים מפרקים פחמימנים מבתי גידול מימיים. הפרוטוקול מתאר בידוד חיידקים, זיהוי בשיטת 16S rRNA, ובדיקת פוטנציאל פירוק הפחמימנים שלהם. מאמר זה יסייע לחוקרים לאפיין מגוון ביולוגי מיקרוביאלי בדגימות סביבתיות, ובמיוחד לסנן מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי.
Abstract
מזהמים פחמימנים עמידים להתכלות והצטברותם בסביבה רעילה לכל צורות החיים. חיידקים מקודדים אנזימים קטליטיים רבים והם מסוגלים באופן טבעי לעכל פחמימנים. מדענים רותמים את המגוון הביולוגי במערכות אקולוגיות ימיות כדי לבודד חיידקים בעלי פוטנציאל פירוק ביולוגי וריפוי ביולוגי. מבודדים כאלה מהסביבה מספקים מערך עשיר של מסלולים מטבוליים ואנזימים, אשר ניתן להשתמש בהם עוד יותר כדי להרחיב את תהליך הפירוק בקנה מידה תעשייתי. במאמר זה נתאר את התהליך הכללי של בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים מבתי גידול מימיים ונסקור את יכולתם לנצל פחמימנים כמקור הפחמן היחיד במבחנה באמצעות טכניקות פשוטות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בידודם של מיני חיידקים שונים ואת זיהויים לאחר מכן באמצעות ניתוח rRNA 16S. הפרוטוקול מציג גם שלבים לאפיון פוטנציאל פירוק הפחמימנים של מבודדי חיידקים. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים המנסים לבודד מיני חיידקים מבתי גידול סביבתיים עבור היישומים הביוטכנולוגיים שלהם.
Introduction
פחמימנים (HC) נמצאים בשימוש נרחב הן כדלקים והן ביישומים כימיים. פחמימנים ארומטיים כגון בנזן, טולואן וקסילן נמצאים בשימוש נרחב כממסים1. אלקנים כגון אתילן ופרופילן משמשים כמבשרי בסינתזה של פוליאתילן ופוליפרופילן, בהתאמה. פילמור של פחמימן אחר, סטירן יוצר פוליסטירן. פעילויות אנתרופוגניות מציגות פחמימנים לסביבה במהלך הייצור וההובלה שלהם. זיהום פחמימני של קרקע ומים יש חששות רציניים לסביבה ובריאות האדם. מיקרובים ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על המערכת האקולוגית על ידי ויסות המחזורים הביו-גיאוכימיים וניצול מגוון רחב של מצעים, הכוללים גם מזהמים וקסנוביוטיקה, וממירים אותם לפחמן ולמקור אנרגיה. תהליך זה של ניקוי רעלים של מזהמים סביבתיים על ידי מיקרואורגניזמים ידוע בשם bioremediation 3,4,5,6,7.
מיקרואורגניזמים בעלי יכולת פירוק פחמימנים נמצאים בבתי גידול מימיים וקרקעיים 8,9,10. זוהו חיידקים רבים עם פוטנציאל לפרק אלקנים וHCs ארומטיים, כגון Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter ו- Oleibacter11. הפיתוח של גישות מתקדמות מבחינה טכנולוגית שאינן תלויות בתרבות סייע לגלות קהילות מיקרוביאליות חדשות המפילות HC12. חומר גנומי המבודד ישירות מדגימות המקור מוגבר ומרוצף על ידי שיטות תפוקה גבוהה כגון ריצוף הדור הבא (NGS) ואחריו ניתוח המבטל את הצורך לטפח מיקרואורגניזמים. שיטות NGS, כגון ניתוח מטא-גנום, הן יקרות וסובלות מחסרונות הקשורים לתהליך ההגברה13. טכניקות גידול כגון תרבית העשרה סלקטיבית14 המכוונות לבידוד של מיקרובים מפרקים פחמימנים עדיין שימושיות מכיוון שהן מאפשרות לחוקרים לחקור ולתפעל מסלולים מטבוליים במבודדים חיידקיים.
בידוד דנ"א גנומי וריצוף החומר הגנומי לאחר מכן חושפים מידע רב ערך על כל אורגניזם. ריצוף גנום שלם מסייע בזיהוי גנים המקודדים עמידות לאנטיביוטיקה, מטרות פוטנציאליות לתרופות, גורמי אלימות, טרנספורטרים, אנזימים קסנוביוטיים-מטבוליזם וכו '15,16,17. ריצוף הגן המקודד 16SrRNA הוכח כטכניקה חזקה לזיהוי פילוגניה חיידקית. שימור רצף הגן ותפקודו לאורך השנים הופך אותו לכלי אמין לזיהוי חיידקים לא מוכרים ולהשוואת מבודד למין הקרוב ביותר. בנוסף, אורכו של גן זה הוא אופטימלי לניתוח ביואינפורמטיקה18. כל התכונות הללו, יחד עם קלות הגברה גנטית באמצעות פריימרים אוניברסליים ושיפור בטכנולוגיית ריצוף גנים, הופכות אותו לתקן זהב לזיהוי חיידקים.
במאמר זה אנו מתארים הליך לשחזור מיקרואורגניזמים הניתנים לטיפוח עם פוטנציאל פירוק HC מדגימות סביבתיות. השיטה המתוארת להלן מתארת את האיסוף והזיהוי של חיידקים מפרקים HC ומחולקת לחמישה חלקים: (1) איסוף חיידקים מדגימות מים, (2) בידוד תרביות טהורות, (3) חקירת יכולת פירוק HC של מבודדי חיידקים (4) בידוד DNA גנומי, ו-(5) זיהוי המבוסס על ריצוף גנים 16S rRNA וניתוח BLAST. הליך זה יכול להיות מותאם לבידוד חיידקים עבור יישומים ביוטכנולוגיים רבים ושונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. איסוף, עיבוד וניתוח דגימות
הערה: כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חיידקים מבתי גידול מימיים. חלק מהמבודדים עשויים להיות פתוגניים, לכן, ללבוש כפפות ולחטא את אזור העבודה לפני ואחרי השימוש.
- אספו דגימת מים של 500 מ"ל בחמישה בקבוקי זכוכית סטריליים מאתרים שונים בגוף המים. מדוד את ה- pH והטמפרטורה של כל דגימה באמצעות מד pH ומדחום, בהתאמה.
הערה: הפרוטוקול אינו ספציפי לאתר וניתן להתאים אותו בקלות גם לבידוד אורגניזמים מגופי מים מזוהמים בפחמימנים. - סנן את הדגימה בגיליונות מסנן בגודל 100 מ"ל עד 0.22 מיקרומטר בגודל נקבוביות, בתנאים אספטיים.
הערה: קוטר נייר הסינון לא יעלה על קוטר צלחת הפטרי. לדוגמה, נייר סינון בקוטר שאינו עולה על 85 מ"מ הוא אופטימלי עבור צלחת פטרי 100-120 מ"מ. - שמרו את ניירות הסינון על לוחות חומרי הזנה שונים (PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 ו-M2G22). הסוגים השונים של אמצעי הצמיחה מאפשרים בחירה והעשרה של מיקרואורגניזמים שונים. הרכבים של מדיות צמיחה שונות מפורטים בטבלה 1. השתמש בנייר אחד לכל צלחת מדיה וקילף לאחר שעתיים באמצעות מלקחיים סטריליים.
- יש לדלל באופן סדרתי את דגימות המים הלא מסוננים (10,6 דילול) במים סטריליים בזיקוק כפול סטרילי על ידי הוספת 100 מיקרוליטר מדגימת המים שנאספה ב-900 מיקרוליטר מים סטריליים. התוצאה היא דילול של 1:10. מדגימה זו, לקחת 100 μL ולהוסיף 900 μL של מים סטריליים כדי לקבל דילול 1:100. חזור על הדילול עד שקיפול הדילול הוא 1:1,000,000. מערבבים על ידי pipetting. הנפח הסופי של כל דילול יהיה 1 מ"ל.
- יש לפזר 100 μL של דגימת המים המדוללים בנפרד על כל לוחות מצעי הגידול המוזכרים בשלב 3 בטריפליקטים.
- לדגור את הצלחות ב 30 ° C במשך 24 עד 48 שעות בהתאם לצמיחה של מושבות.
הערה: רוב המבודדים הסביבתיים גדלים בטמפרטורה אופטימלית של 30 מעלות צלזיוס. אם מבודדים את הדגימות מסביבה עם טמפרטורות קיצוניות, יש לדגור על הלוחות באותה טמפרטורה כמו זו של אתר האיסוף. - לאחר מכן, בחרו את המושבות באמצעות קיסם סטרילי או קצה פיפטה ובצעו פסים רבועים כדי לקבל מושבות מבודדות.
- דוגרים על הצלחות למשך הלילה. למחרת, סנן את המושבות על פי תכונותיהן המורפולוגיות כגון צבע, מרקם, צורה, גודל, שוליים, גובה וכו'. לפזר מחדש את המושבות כדי להשיג תרבויות טהורות.
- בצע צביעת גרם של כל תרבית טהורה23 והמשך בהכנת מלאי גליצרול.
- כדי להכין את מלאי הגליצרול, לחסן מושבה אחת ב 3 מ"ל של מצע גידול מתאים לדגור ב 30 ° C. מתרבית לילה, לקחת 700 μL ולהוסיף 300 μL של 100% גליצרול (מעוקר על ידי autoclaving) cryovials24. הקפיאו את הבקבוקונים בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.
2. השפלה של פחמימנים
הערה: הדוגמה הבאה היא לסנן את המבודדים שיכולים לפגוע בסטירן. זהו שינוי קל של השיטה שהותאמה בדו"ח קודם25. בצע את השלבים בתנאים אספטיים.
- מצלחת פסים טרייה, בחרו מושבה וחסנו ב-5 מ"ל של ציר סויה טריפטי (TSB)/ציר מזין (NB). הגדילו את התרבית לילה ב-30°C עם רעידות ב-200 סל"ד עד שהספיגה מגיעה ~2.
הערה: מלבד TSB/NB, ניתן לבחור כל מדיום גידול שבו החיידקים מגיעים לצפיפות תאים גבוהה. - למחרת, גלולה את התאים ב 2862 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לזרוק את supernatant.
- לשטוף את הגלולה פעמיים עם 2 מ"ל של מלוחים autoclaved (0.9% NaCl) ולסובב ב 2862 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
הערה: מי מלח הם איזוטוניים, ולכן הם שומרים על הלחץ האוסמוטי בתוך תאי חיידקים. - השהה מחדש את הגלולה ב -2 מ"ל של מדיום בסיסי נוזלי נטול פחמן (LCFBM). מדוד את הספיגה (OD600).
- קח שתי צלוחיות Erlenmeyer סטריליות עם קיבולת 150 מ"ל לבקרה ואת קבוצת הניסוי. תייגו אותם כ-A ו-B.
- בקבוצת הביקורת הלא מחוסנת (בקבוק A), יש להוסיף 40 מ"ל LCFBM וסטירן (5 מילימול).
- בבקבוק B, להוסיף 35 מ"ל של LCFBM וסטירן (להתאים את הריכוז הסופי של סטירן ל 5 mM). הוסף את תרחיף התא עם OD600 סופי של תאים ≈ 0.1 והשלם את הנפח הנותר עם LCFBM עד 40 מ"ל. לדגור על צלוחיות ב 30 ° C עם רעד ב 200 סל"ד במשך 30 ימים.
הערה: פחמימנים עודף יכול להיות רעיל עבור חיידקים, ולכן, להתחיל עם ריכוז נמוך בהדרגה להגדיל אותו. - חזור על האמור לעיל עבור כל זן נוסף שיש להעריך עבור פירוק פחמימנים.
- מדדו את OD600 של כל בקבוק כל 5 ימים והתוו עקומת גדילה. הגדילו את הדגירה עד 45 יום אם החיידקים יכולים להשתמש בסטירן. עלייה ב-OD600 מצביעה על כך שהחיידק יכול לעכל סטירן.
3. בדיקת פירוק קטכול על ידי מבודדי חיידקים
הערה: פירוק פחמימנים ארומטיים כגון סטירן, בנזן, קסילן, נפתלן, פנולים וכו 'מייצרים קטכולים כמתווכי תגובה. הקטכולים עוברים מטבוליזם נוסף על ידי חיידקים בעזרת אנזימי קטכול 1,2-דיאוקסיגנאז וקטכול 2,3-דיאוקסיגנאז דרך המסלולים האורתודוקסיים והמטא-מחשוף, בהתאמה26. אנזימים אלה מעורבים גם בפירוק של פחמימנים אחרים כגון כלורובנזן27. הפרוטוקול המוזכר להלן משתמש בליזט של תאים שלמים עבור קטכול 2, בדיקת אנזים 3-דיאוקסיגנאז28. באותה שיטת ליזה ניתן להשתמש כדי לסנן את הפעילות של catechol 1, 2-dioxygenase. עם זאת, הרכב תערובת התגובה ישתנה. שני האנזימים ניתנים להשראה בטבע ויכולים להיגרם על ידי הוספת פנול למצע הגדילה.
- בעזרת לולאה סטרילית, לחסן את מושבת החיידקים מצלחת פסים טריים לתוך מלחים מינרליים בינוניים (MSM) בתוספת 1-4 mM פנול. לדגור על התרבית ב 30 ° C ו 200 סל"ד. קצור את התרבית ב 4 ° C כאשר OD 600 מגיע בין 1.4-1.6 (כלומר, בשלב מעריכי מאוחר) על ידי סיבוב ב4500 x גרם במשך 20 דקות.
- לשטוף את גלולת התא עם חיץ פוספט (0.5 M, pH 7.5).
- השהה מחדש את התאים במאגר הפוספט שהוזכר לעיל והתאם את OD600 ≈ 1.0 הסופי.
- ליזה את התאים על ידי סוניקציה פועמת במשך 1.5 דקות, משך כל פעימה הוא 15 שניות. לאחר שלב זה, המתלים חייבים להיות ברורים או פחות עכורים. אם לא, להגדיל את מספר פולסים ולבדוק אם המתלים ברורים. לאחר כל פעימה, יש לשמור את הדגימה על קרח כדי למנוע פירוק חלבון.
- הסר את פסולת התא ואת התאים שאינם שבורים על ידי צנטריפוגה ב 9,000 x גרם למשך 30 דקות, תוך שמירה על הטמפרטורה הקרה (4 ° C).
- בזהירות פיפטה את supernatant ברור. חלק זה מכיל את התמצית הגולמית לבדיקת אנזימים.
- קבע את ריכוז החלבון של תמצית גולמית על ידי ברדפורד או שיטתלורי 29,30.
- כדי לקבוע את הפעילות של catechol 2,3-dioxygenase, למדוד את היווצרות של המוצר הסופי התגובה (2-hydroxymuconic semialdehyde) על ידי ספקטרופוטומטר.
- הכן את תערובת התגובה על ידי הוספת 20 μL של catechol (50 mM), 960 μL של חיץ פוספט (50 mM, pH 7.5), ו 20 μL של תמצית גולמית.
- עבור הבקרה השלילית, החלף את התמצית הגולמי במאגר פוספט והתאם את הנפח הסופי ל -1 מ"ל.
- דוגרים על תערובת התגובה במשך 30 דקות. במרווחי זמן קבועים, מדדו את הספיגה ב-375 ננומטר. עלייה בספיגה מצביעה על היווצרות המוצר הסופי של התגובה, 2-hydroxymuconic acid semialdehyde (2-HMS). בצע את הניסוי בטריפליקטים.
הערה: קטצ'ול רגיש לאור ורגיש לחמצן. אחסנו את תערובת התגובה בחושך וסגרו את הצינורות היטב כדי למנוע התפרקות טבעית של קטכול.
4. בידוד DNA גנומי של התרבות הטהורה
הערה: זהו הפרוטוקול הכללי לבידוד DNA גנומי. צביעת גרם בוצעה במהלך שלב איסוף הדגימה, עיבודה וניתוחה. בשל השונות בעובי דופן התא של חיידקים גראם חיוביים וגראם-שליליים, שיטת הליזה התאית משתנה בהתאם. יש ללבוש כפפות בזמן הבידוד ולחטא את שולחן העבודה עם 70% אתנול כדי למנוע מהנוקלאזות לפגוע ב-DNA. חלק מהכימיקלים המוזכרים להלן עלולים לגרום לכוויות חמורות על העור ויש לנקוט בזהירות נאותה בעת הטיפול בהם.
- בידוד DNA גנומי מחיידקים גראם-שליליים31.
- בחרו מושבה בודדת וחסנו במצע גידול טרי במבחנות סטריליות.
- הניחו את הצינורות בשייקר אינקובטור ב-200 סל"ד ואפשרו לחיידקים לגדול בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס.
- למחרת, גלולה 1.5 מ"ל של תרבית לילה גדל ב 12,400 x גרם במשך 3 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 200 μL של חיץ ליזה (40 mM Tris-אצטט, pH 7.8, 20 mM נתרן אצטט, 1 mM EDTA, 1% SDS).
- מוסיפים 66 μL של תמיסת NaCl (5 M) ומערבבים היטב.
- מזלפים את התערובת המתקבלת על 12,400 x גרם במשך 10 דקות (4 ° C).
- פיפטה הסופרנאטנט השקוף בצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ומוסיפים נפח שווה של כלורופורם.
- הפוך לערבב את התמיסה מספר פעמים עד פתרון חלבי הוא ציין.
- מסתובבים ב 12,400 x גרם במשך 3 דקות ומעבירים את supernatant לבקבוקון נקי.
- הוסף 1 מ"ל של 100% אתנול קר כקרח; מערבבים בהיפוך עד שגדילים לבנים של דנ"א מזרזים החוצה.
- צנטריפוגו את הדנ"א המואץ ב-2,200 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C והשליכו את הסופר-נטנט.
- שטפו את גלולת הדנ"א ב-1 מ"ל של 70% אתנול והניחו לגלולת הדנ"א להתייבש במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הייבוש, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-100 μL של מאגר Tris-EDTA(TE) אחד, ולאחסן את הדנ"א בטמפרטורה של -20°C.
- למדוד את הריכוז (A260/280) באמצעות ספקטרופוטומטר ולהריץ את הדנ"א על ג'ל אגרוז (1%) כדי להעריך את איכות DNA24.
- בידוד DNA גנומי מזן גראם-חיובי32
- בחרו מושבה בודדת וחסנו במצע גידול טרי במבחנות סטריליות.
- הניחו את הצינורות בשייקר אינקובטור ב-200 סל"ד ואפשרו לחיידקים לגדול במשך הלילה בטמפרטורת גידול מתאימה.
- למחרת, קח 1.5 מ"ל של התרבית המגודלת וצנטריפוגה ב 8,600 x גרם במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend את התאים במאגר TE.
- כוונן את OD600 = 1.0 עם מאגר TE והעבר 740 μL של מתלה התא לצינור מיקרופוגה נקי.
- מוסיפים 20 μL של lysozyme (100 מ"ג / מ"ל ציר) ומערבבים היטב על ידי pipetting. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות (באמבט יבש).
- מוסיפים 40 μL של 10% SDS ומערבבים היטב.
- הוסף 8 μL של פרוטאינאז K (10 מ"ג / מ"ל). מערבבים היטב ודגרים ב 56 ° C במשך 1-3 שעות (באמבטיה יבשה). המתלה אמור להתבהר כעת עם צמיגות מוגברת, המסמנת ליזה יעילה של תאים.
הערה: ניתן להשאיר את המתלה למשך הלילה אם התאים אינם מונחים כראוי. - חממו מראש את תערובת CTAB/NaCl ב-65°C (באמבט יבש) והוסיפו 100 μL של תערובת זו לתרחיף התא. מערבבים היטב.
- יש לדגור בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות (באמבט יבש).
- מוסיפים 500 μL של כלורופורם:אלכוהול איזואמיל (24:1) ומערבבים היטב. סחור ב-16,900 x גרם למשך 10 דקות ב-25°C.
- מעבירים את הפאזה המימית לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי תוך הימנעות מהפאזה האורגנית (השלב הצמיגי בתחתית).
- בזהירות להוסיף 500 μL של פנול:chloroform:isoamyl אלכוהול (25: 24: 1) ולערבב היטב. סחור ב-16,900 x גרם למשך 10 דקות ב-25°C.
- קח את השלב המימי בצינור מיקרוצנטריפוגה טרי. מוסיפים 500 μL של כלורופורם:אלכוהול איזואמיל (24:1) ומערבבים היטב.
- מעבירים את הפאזה המימית ומוסיפים איזופרופנול בנפח 0.6 (מקורר ב-20°C-).
- גדילי הדנ"א המושקעים חייבים להיות גלויים בצורה דמוית חוט. יש לדגור בטמפרטורה של -20°C למשך שעתיים עד לילה.
- צנטריפוגה ב 16,900 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C כדי לגלול את ה- DNA.
- דקנט את isopropanol בזהירות לשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של אתנול קר 70% (prechilled ב -20 ° C) כדי להסיר כל זיהומים.
- צנטריפוגה ב 16,900 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
- הניחו לגלולה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות או השאירו את הצינור בטמפרטורה של 37°C. יש לוודא שהגלולה אינה מיובשת יתר על המידה.
- יש להשהות מחדש ב-100 μL של מאגר TE 1x ולאחסן את הדנ"א בטמפרטורה של -20°C.
הערה: אם הגלולה מתייבשת יתר על המידה וקשה להשהיה מחדש, יש לדגור על צינור המיקרוצנטריפוגה עם כדורית DNA ומים נטולי נוקלאז בטמפרטורה של 37°C למשך 15-20 דקות ולהשהות שוב על ידי פיפט. - למדוד את הריכוז (A260/280) באמצעות ספקטרופוטומטר לאחר ביצוע דילול 1:100 במאגר TE 1x ולהריץ את הדנ"א על ג'ל אגרוז (1%) כדי להעריך את איכות DNA24.
5. ריצוף rRNA 16S
הערה: הפרוטוקול המתואר להלן הוא להגברה וריצוף של 16S rRNA לזיהוי חיידקים. מידע הנגזר מרצף rRNA 16S משמש לזיהוי אורגניזם לא ידוע ולמציאת הקשר בין אורגניזמים שונים.
- כדי לזהות את הזנים, הגבירו את הדנ"א שבודד מתרביות החיידקים הטהורים על ידי PCR עם פריימרים אוניברסליים המכוונים לרצף rRNA 16S עבור חיידקים: 27F (5'-AGAGTTTCMTGGCTCAG-3') ו-1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
- הכינו את תערובת ה-PCR (תגובות של 25 μL) על קרח עם 18 μL של מים נטולי autoclaved/nuclease, 2.5 μL של חיץ 10x, 0.5 μL של פריימרים קדמיים ואחוריים (100 μM מלאי), 2 μL של תערובת dNTPs (100 μM מלאי), 1 μL של תבנית DNA (2-15 ng/μL) ו-1 U של Taq Polymerase.
- השתמש בתנאי המחזור הבאים להגברת גן rRNA 16S: דנטורציה ראשונית ב- 94 ° C למשך 10 דקות, (דנטורציה סופית ב- 94 ° C למשך 40 שניות, חישול פריימר ב- 56 ° C למשך דקה אחת, הארכה ב- 74 ° C למשך 2 דקות) x 30 מחזורים, הארכה סופית ב- 74 ° C למשך 10 דקות.
- לאחר סיום המחזור, ערבבו 5 μL של דגימה ו-1 μL של 5x צבע טעינת DNA. יש למרוח על ג'ל אגרוז 1% כדי לוודא את ההגברה. אחסנו את מוצרי ה-PCR בטמפרטורה של 4°C לטווח קצר או הקפיאו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף.
- עבור ריצוף גן rRNA 16S, הגדר את אותה תגובה שהוזכרה לעיל עבור נפח גבוה יותר (100 μL).
- לטהר את האמפליקונים לריצוף סנגר24,34 באמצעות ערכת טיהור מוצר PCR או לערבב את הדגימה כולה עם צבע טעינת DNA ולהעמיס על ג'ל אגרוז לביצוע שיטת מיצוי ג'ל.
- לאחר סיום הרצף, המר את קובץ התוצאות בפורמט FASTA ובדוק את דמיון הרצף עם כלי חיפוש היישור המקומי הבסיסי (BLAST) ב- NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הסכמטי המתאר את כל התהליך לבידוד וסינון של חיידקים מסביבות מימיות וזיהויים לאחר מכן על-ידי ניתוח rRNA 16S מיוצג באיור 1. דגימות מים מביצות בדדרי, הודו, נאספו בבקבוקי זכוכית סטריליים ונלקחו מיד למעבדה לעיבוד. הדגימות הועברו דרך גיליונות סינון בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר, וניירות הסינון נשמרו במגע עם לוחות מדיה שונים. לאחר שעתיים הוסרו ניירות הסינון, והלוחות הודגרו במשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס לצורך היווצרות מושבות (איור 2). למחרת נבחרו מושבות חיידקים בודדות שפוזרו על לוחות מדיה טריים (איור 2). התרבות הטהורה שנוצרה אוחסנה ולאחר מכן שימשה לניתוח נוסף. באמצעות שיטה זו הצלחנו ליצור ספרייה של יותר מ-100 חיידקים מבודדים ייחודיים. מטרתנו הייתה לזהות חיידקים מבודדים שיכולים לנצל פחמימנים, במיוחד סטירן, שהוא המרכיב העיקרי של פלסטיק חד-פעמי. החיידקים המבודדים גודלו בנפרד במדיה המתאימה עם תוספת של סטירן נוזלי כמקור יחיד לפחמן (איור 3). אנו יכולים לזהות ארבעה מבודדים המשתמשים בסטירן כמקור יחיד לפחמן. שניים מהמבודדים אופיינו בהרחבה בהמשך להשפלת סטירן25.
לאחר מכן נבדקו המבודדים החיידקיים לנוכחות מסלולים אנזימטיים לפירוק מטבוליזם פחמימני. מטבוליזם פחמימני בחלק מהחיידקים גורם לייצור קטכולים כמתווכים, אשר מתפרקים עוד יותר על ידי מסלולים אורתו-מחשוף ומטה-מחשוף. אנזימי קטכול 1,2- דיאוקסיגנאז וקטכול 2,3-דיאוקסיגנאז אחראים לתגובת מחשוף טבעתי36. חיידקים סביבתיים בעלי אנזימים אלה הוכחו כמעכלים מספר תרכובות ארומטיות. לפיכך, בוצעה בדיקת פירוק קטכול כדי להעריך את פוטנציאל פירוק HC של חיידקים מבודדים (איור 4). בדיקה מייצגת של אחד המבודדים מוצגת באיור 4.
כדי לזהות את מבודדי החיידקים, בוצע ריצוף rRNA 16S. בוצעה צביעת גרם ראשונית לאפיון החיידק, המסייעת לזהות ולפתור את השלבים הבאים. חיידקים גראם-חיוביים הם בדרך כלל עקשנים למאגרי ליזה של תאים, מה שמוביל לתפוקת דנ"א גנומית נמוכה37. לפיכך, התוצאות המתקבלות מצביעת גרם38 לפני בידוד DNA גנומי יסייעו בבחירת הפרוטוקול לבידוד DNA גנומי. לאחר בידוד דנ"א, שלמות הדנ"א הגנומי אושרה על-ידי הדמיה של דגימה קטנה של דנ"א על ג'ל אגרוז (איור 5A) וכומתה על-ידי שיטת ספיגת UV באמצעות ספקטרופוטומטר. הגן rRNA 16S הוגבר באמצעות רצף פריימרים אוניברסלי (איור 5B). בעוד 500 bp חיוניים לריצוף, תוצאות אידיאליות מתקבלות עם 1,300-1,500 bp39. כדי לקבל את מידת הקרבה בין זנים מבודדים, נבנה עץ פילוגנטי באמצעות תוכנת phylogeny.fr40 (איור 6).
איור 1: זרימת עבודה סכמטית של המחקר לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות של מושבות חיידקים מדגימות מים. דגימת המים שנאספה הועברה דרך נייר סינון של 0.22 מיקרומטר. ניירות הסינון נשמרו על לוחות מדיה שונים. הלוחות הודגרו במשך 24-48 שעות עד שנצפו מושבות מבודדות. המושבות הבודדות פוזרו אז על צלחות טריות לבידוד תרבותי טהור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות מייצגות של פירוק מיקרוביאלי של סטירן וסינון פוטנציאל פירוק פחמימנים של חיידקים. התאים גודלו ב-LCFBM בתוספת סטירן של 5 מילימטר כמקור פחמן יחיד למשך 40 יום ב-30 מעלות צלזיוס וב-200 סל"ד. OD600 נמדד כל 5 ימים. בקבוק הבקרה היה רק LCFBM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ייצוג של בדיקת אנזים קטכול 2,3-דיאוקסיגנאז כדי לעקוב אחר פירוק קטכול. (A) קטכול המצע חסר הצבע מומר למוצר בצבע צהוב על ידי פעולה של קטכול 2,3-דיאוקסיגנאז. תערובת התגובה מכילה קטכול, חיץ פוספט וליזט תאי גולמי. היווצרות המוצר מזוהה על ידי מדידת ספיגה ב 375 ננומטר. (B) גרף מייצג של בדיקת אנזים catechol 2,3-dioxygenase עם ליזט של תאים שלמים. לתערובת התגובה בבקרה שלילית יש מצע חיץ וקטכול ללא ליזט תא. הספיגה נמדדה ב-375 ננומטר במרווח של 10 דקות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בידוד דנ"א גנומי ו-16S rRNA PCR. (A) אלקטרופורזה בג'ל של דנ"א גנומי מבודד. נתיב M: סמן גודל DNA, נתיב 1-2: DNA גנומי. (B) אימות של הגברה גנטית rRNA 16S על ידי אלקטרופורזה של 1% ג'ל. ג'לים הודגמו על ידי צביעה עם אתידיום ברומיד; נתיב M: סמן גודל DNA (1 קילובייט), נתיב 1-4: מוצרי PCR מוגברים מזנים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח תוצאות ריצוף הגן rRNA 16S. בניית דנדרוגרמה ייצוגית באמצעות תוכנית phylogeny.fr כדי לתאר את הקרבה בין זני Exiguobacterium שבודדו מביצות (מודגשות בקופסה אדומה) עם Exiguobacterium sp הידוע. רצפי rRNA 16S של Exiguobacterium sp. ידועים התקבלו מ- NCBI. נתון זה נלקח ממאמר קודם (Chauhan et.al.) ללא כל שינוי25. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| תמצית שמרי פפטון (PYE) | |
| פפטון | 2 גרם |
| תמצית שמרים | 1 גרם |
| 1M MgSO4 | 1 מ"ל |
| 1M CaCl2 | 1 מ"ל |
| מים מזוקקים | עד 1000 מ"ל |
| יש לעקר על-ידי כריתה אוטומטית בטמפרטורה של 121°C ו-15°C למשך 15 דקות. | |
| Reasoner's 2A (R2A) | |
| חומצה קזאין הידרוליזט | 0.5 גרם |
| תמצית שמרים | 0.5 גרם |
| פרוטאז פפטון | 0.5 גרם |
| דקסטרוז | 0.5 גרם |
| עמילן, מסיס | 0.5 גרם |
| K2HPO4 | 0.5 גרם |
| מים מזוקקים | עד 1000 מ"ל |
| יש לעקר על-ידי כריתה אוטומטית בטמפרטורה של 121°C ו-15°C למשך 15 דקות. | |
| M2G | |
| 10X מלחי M2 (1L) - | |
| נא2HPO4 | 17.4 גרם |
| KH2PO4 | 10.6 גרם |
| NH4Cl | 5.0 גרם |
| מלחי Autoclave 10X M2 ב-121°C ו-15 PSI למשך 15 דקות. | |
| 10X מלחי M2 | 100 מ"ל |
| 50mM MgCl2 | 10 מ"ל |
| 30% גלוקוז (ללא חום) | 10 מ"ל |
| 1 מ"מ FeSO4 אינץ' 0.8 mM EDTA, pH 6.8 | 10 מ"ל |
| 50 מ"מ CaCl2 | 10 מ"ל |
| מים מזוקקים | עד 1000 מ"ל |
| סינון סטריליזציה. | |
| מרק ליזוגני (LB) | |
| הידרוליזה אנזימית קזאין | 10 גרם |
| תמצית שמרים | 5 גרם |
| NaCl | 10 גרם |
| מים מזוקקים | עד 1000 מ"ל |
| יש לעקר על-ידי כריתה אוטומטית בטמפרטורה של 121°C ו-15°C למשך 15 דקות. | |
| ציר חומרים מזינים (NB) | |
| פפטון | 15 גרם |
| תמצית שמרים | 3 גרם |
| NaCl | 6 גרם |
| גלוקוז | 1 גרם |
| מים מזוקקים | עד 1000 מ"ל |
| יש לעקר על-ידי כריתה אוטומטית בטמפרטורה של 121°C ו-15°C למשך 15 דקות. | |
| מרק סויה טריפטי (TSB) | |
| עיכול הלבלב של קזאין | 17.0 גרם |
| עיכול פאפאי של ארוחה סויה | 3 גרם |
| NaCl | 5 גרם |
| K2HPO4 | 2.5 גרם |
| דקסטרוז | 2.5 גרם |
| מים מזוקקים | עד 1000 מ"ל |
| יש לעקר על-ידי כריתה אוטומטית בטמפרטורה של 121°C ו-15°C למשך 15 דקות. | |
| M63 | |
| NH4Cl | 2 גרם |
| KH2PO4 | 13.6 גרם |
| FeSO4.7H 2O | 0.5 מ"ג |
| 20% גליצרול | 10 מ"ל |
| 1M MgSO4 | 1 מ"ל |
| מים מזוקקים | עד 1000 מ"ל |
| מדיה מינימלית M9 | |
| 5X מלחי M9 | |
| Na2 HPO4.7H 20 | 12.8 גרם |
| KH2PO4 | 3 גרם |
| NH4Cl | 1 גרם |
| NaCl | 0.5 גרם |
| מים מזוקקים | עד 200 מ"ל |
| מלחי Autoclave 5X M9 בטמפרטורה של 121°C ו-15PSI למשך 15 דקות. | |
| 1X מדיה M9 | |
| 5X מלחי M9 | 20 מ"ל |
| 20% גלוקוז | 2 מ"ל |
| 1M MgSO4 | 200 מיקרוליטר |
| 1M CaCl2 | 10 מיקרוליטר |
| מים אוטוקלאביים | עד 100 מ"ל |
| הערה – להכנת מדיה מוצקה, יש להשתמש באגר Bacto 1.5% (15 גרם/ליטר) |
טבלה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה מבוסס היטב כי רק כ 1% של חיידקים על כדור הארץ ניתן לטפח בקלות במעבדה6. אפילו בקרב החיידקים הניתנים לטיפוח, רבים נותרים בלתי מאופיינים. שיפורים בשיטות מולקולריות העניקו ממד חדש לניתוח ולהערכה של קהילות חיידקים. עם זאת, לטכניקות כאלה יש מגבלות, אך הן אינן מייתרות את ניתוחי התרבות. טכניקות תרבית טהורות לבידוד מיני חיידקים בודדים נותרו המנגנון העיקרי לאפיון תכונות פיזיולוגיות. בתי גידול קרקעיים ומימיים מכילים חיידקים רבים בעלי אנזימים ומסלולים חדשים, אותם ניתן לרתום לשימושים ביוטכנולוגיים. מחקר זה מתאר שיטה פשוטה וזולה לבידוד ואפיון חיידקים מדגימות אקולוגיות.
לחיידקים שונים יש דרישות תזונתיות שונות, ולכן נעשה שימוש במצעי גדילה שונים כדי להגדיל את ההסתברות לבודד מיני חיידקים מגוונים. מגבלה עיקרית אחת של שיטה זו היא שמיקרובים עם דרישות גדילה קפדניות עשויים להישלל. כמו כן, המטרה העיקרית של צעד זה היא למקסם את מספר מיני החיידקים המתקבלים מהדגימה. מספר מיני החיידקים בספריית הדגימות ישפר את הסיכויים לבודד מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי. למרות ששינינו רק את מצעי הגדילה, טמפרטורת גדילה משתנה וריכוז חמצן יכולים גם להגדיל את הסיכויים להרחיב עוד יותר את ספריית הדגימות עם מינים ייחודיים41,42.
שלב קריטי בפרוטוקול הוא בדיקת ניצול המצע הנבדק (סטירן במקרה שלנו). חשוב לתכנן את הניסוי לחקירה כזו בזהירות כדי למנוע תוצאות שליליות שגויות. בהתאם למאפייני הגדילה, ייתכן שהחיידק לא יסתגל באופן מיידי לניצול המצע הנבדק ועשוי לדרוש תהליך העשרה. במקרה שלנו, צמיחת החיידקים איטית בתווך LCFBM המשמש לבדיקת ניצול הפחמימנים כמקור הפחמן היחיד25. כדי לעקוף בעיה זו, ניתן להתחיל תרביות ראשוניות על ידי הוספת (1% v/v) TSB או NB למדיום LCFBM כדי לתמוך בצמיחת חיידקים. זיהוי החיידק המתורבת מתבצע באמצעות ריצוף rRNA 16S43. שיטה זו מציעה שיטה חזקה וחסכונית לזיהוי מיקרוביאלי. עם זאת, ריצוף 16S יכול לספק רק זיהוי טקסונומי ברמה גבוהה יותר. לזיהוי ספציפי ברמת המינים, יש להשתמש בפריימרים ספציפיים אחרים למשפחה בשילוב עם בדיקות ביוכימיות שונות44,45.
בדיקת אנזים עם ליזט של תאים שלמים דורשת שימוש בשיטת ליזה תאית יעילה. ליזה של תאים חיידקיים מושגת בדרך כלל על ידי ביצוע סוניקציה. עם זאת, שיטת הקפאה-הפשרה היא שיטה חלופית לליזה עדינה של תאים, אשר מאמינים כי היא מונעת דנטורציה של חלבון. ההליך מורכב מהקפאה מהירה של התאים ב -80 ° C והפשרה ב 4 ° C באופן רציף46. תוספת של דטרגנטים קלים כגון NP-40 או Triton-X-100 מסייעת גם בליזה התאית ואינה מנטרלת את החלבונים, בשל אופיים הלא יוני47. עם זאת, חיידקים בעלי דפנות תאים עבות כגון ציאנובקטריה48 עשויים שלא להפיק תועלת משיטת הליזה התאית העדינה באמצעות דטרגנטים49 ולכן יש לבחור את שיטת הליזיס לבדיקת אנזימים בהתאם.
על ידי התמקדות באוכלוסיית החיידקים הניתנת לגידול מדגימות סביבתיות, חוקרים יכולים לבצע במהירות ניסויים רבים ושונים. השיטות המתוארות כאן אינן דורשות שימוש במכשירים מתוחכמים מאוד וניתן לבצע אותן בקלות במערך מעבדה סטנדרטי. מאז פחמימנים וכימיקלים מסוכנים משמשים, המעבדה צריכה להיות מצויד בטיפול נאות וסילוק על פי נהלי הפעלה סטנדרטיים. הגישה המתוארת כאן ניתנת להתאמה בקלות לחקר מגוון מיני חיידקים עבור יישומים ביוטכנולוגיים רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר Karthik Krishnan ולחברי מעבדת RP על הערותיהם והצעותיהם המועילות. DS נתמך על ידי מלגת SNU-Doctoral ומלגת Earthwatch Institute India. מעבדת RP נתמכת על ידי מענק CSIR-EMR וקרנות הזנק מאוניברסיטת שיב נדר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B.
- R, C.
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R.
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
