Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici
Summary
Presentiamo il processo di isolamento, propagazione e caratterizzazione dei batteri che degradano gli idrocarburi dagli habitat acquatici. Il protocollo delinea l’isolamento batterico, l’identificazione con il metodo 16S rRNA e il test del loro potenziale di degradazione degli idrocarburi. Questo articolo aiuterebbe i ricercatori a caratterizzare la biodiversità microbica nei campioni ambientali e in particolare a selezionare i microbi con potenziale di biorisanamento.
Abstract
Gli inquinanti idrocarburici sono recalcitranti alla degradazione e il loro accumulo nell’ambiente è tossico per tutte le forme di vita. I batteri codificano numerosi enzimi catalitici e sono naturalmente in grado di metabolizzare gli idrocarburi. Gli scienziati sfruttano la biodiversità negli ecosistemi acquatici per isolare i batteri con potenziale di biodegradazione e biorisanamento. Tali isolati dall’ambiente forniscono un ricco insieme di percorsi metabolici ed enzimi, che possono essere ulteriormente utilizzati per aumentare il processo di degradazione su scala industriale. In questo articolo, delineiamo il processo generale di isolamento, propagazione e identificazione delle specie batteriche dagli habitat acquatici e analizziamo la loro capacità di utilizzare gli idrocarburi come unica fonte di carbonio in vitro utilizzando tecniche semplici. Il presente protocollo descrive l’isolamento di varie specie batteriche e la loro successiva identificazione utilizzando l’analisi dell’rRNA 16S. Il protocollo presenta anche misure per caratterizzare il potenziale di degradazione degli idrocarburi degli isolati batterici. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che cercano di isolare le specie batteriche dagli habitat ambientali per le loro applicazioni biotecnologiche.
Introduction
Gli idrocarburi (HC) sono ampiamente utilizzati sia come combustibili che in applicazioni chimiche. Gli idrocarburi aromatici come benzene, toluene e xilene sono ampiamente utilizzati come solventi1. Alcheni come etilene e propilene fungono da precursori nella sintesi di polimeri di polietilene e polipropilene, rispettivamente. Polimerizzazione di un altro idrocarburo, lo stirene forma polistirene. Le attività antropiche introducono idrocarburi nell’ambiente durante la loro produzione e trasporto. La contaminazione da idrocarburi del suolo e dell’acqua è fonte di gravi preoccupazioni per l’ambiente e la salute umana. I microbi svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell’ecosistema regolando i cicli biogeochimici e utilizzando una vasta gamma di substrati, che includono anche inquinanti e xenobiotici, convertendoli in carbonio e fonte di energia. Questo processo di disintossicazione dei contaminanti ambientali da parte di microrganismi è noto come biorisanamento 3,4,5,6,7.
I microrganismi con la capacità di degradare gli idrocarburi si trovano negli habitat acquatici e del suolo 8,9,10. Sono stati identificati molti batteri con il potenziale di degradare alcani e HC aromatici, come Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter11. Lo sviluppo di approcci tecnologicamente avanzati indipendenti dalla coltura ha contribuito alla scoperta di nuove comunità microbiche che degradano l’HC12. Il materiale genomico isolato direttamente dai campioni sorgente viene amplificato e sequenziato con metodi ad alta produttività come il sequenziamento di nuova generazione (NGS), seguito dall’analisi eliminando la necessità di coltivare microrganismi. I metodi NGS, come l’analisi del metagenoma, sono costosi e presentano inconvenienti legati al processo di amplificazione13. Le tecniche di coltivazione come la coltura dell’arricchimento selettivo14 che mirano all’isolamento dei microbi che degradano gli idrocarburi sono ancora utili in quanto consentono ai ricercatori di sondare e manipolare le vie metaboliche negli isolati batterici.
L’isolamento del DNA genomico e il successivo sequenziamento del materiale genomico rivelano informazioni preziose su qualsiasi organismo. Il sequenziamento dell’intero genoma aiuta nell’identificazione di geni che codificano per la resistenza agli antibiotici, potenziali bersagli farmacologici, fattori di virulenza, trasportatori, enzimi che metabolizzano gli xenobiotici, ecc15,16,17. Il sequenziamento del gene codificante 16SrRNA ha dimostrato di essere una tecnica robusta per identificare la filogenesi batterica. La conservazione della sequenza e della funzione genica nel corso degli anni lo rende uno strumento affidabile per identificare batteri sconosciuti e confrontare un isolato con le specie più vicine. Inoltre, la lunghezza di questo gene è ottimale per l’analisi bioinformatica18. Tutte queste caratteristiche, insieme alla facilità di amplificazione genica utilizzando primer universali e al miglioramento della tecnologia di sequenziamento genico, lo rendono un gold standard per l’identificazione dei microbi.
Qui, descriviamo una procedura per recuperare microrganismi coltivabili con potenziale di degradazione dell’HC da campioni ambientali. Il metodo descritto di seguito delinea la raccolta e l’identificazione dei batteri che degradano l’HC ed è diviso in cinque sezioni: (1) raccolta di batteri da campioni d’acqua, (2) isolamento di colture pure, (3) esplorazione della capacità di degradazione dell’HC di isolati batterici (4) isolamento del DNA genomico e (5) identificazione basata sul sequenziamento del gene rRNA 16S e analisi BLAST. Questa procedura può essere adattata per isolare batteri per molte diverse applicazioni biotecnologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
È ben noto che solo circa l’1% dei batteri sulla Terra può essere facilmente coltivato in laboratorio6. Anche tra i batteri coltivabili, molti rimangono non caratterizzati. I miglioramenti nei metodi molecolari hanno dato una nuova dimensione all’analisi e alla valutazione delle comunità batteriche. Tuttavia, tali tecniche hanno dei limiti, ma non rendono superflue le analisi colturali. Le tecniche di coltura pura per isolare le singole specie batteriche rimangono il meccanismo primario per la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Karthik Krishnan e i membri del laboratorio RP per i loro utili commenti e suggerimenti. DS è supportato da SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. Il laboratorio RP è supportato da una sovvenzione CSIR-EMR e da fondi di start-up della Shiv Nadar University.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
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