Summary

Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

Published: December 07, 2021
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Summary

Wir stellen den Prozess der Isolierung, Vermehrung und Charakterisierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Das Protokoll beschreibt die Isolierung von Bakterien, die Identifizierung mit der 16S-rRNA-Methode und die Prüfung ihres Kohlenwasserstoffabbaupotenzials. Dieser Artikel würde Forschern helfen, die mikrobielle Biodiversität in Umweltproben zu charakterisieren und insbesondere nach Mikroben mit Bioremediationspotenzial zu suchen.

Abstract

Kohlenwasserstoff-Schadstoffe sind widerspenstig gegenüber dem Abbau und ihre Anreicherung in der Umwelt ist giftig für alle Lebensformen. Bakterien kodieren zahlreiche katalytische Enzyme und sind von Natur aus in der Lage, Kohlenwasserstoffe zu verstoffwechseln. Wissenschaftler nutzen die Artenvielfalt in aquatischen Ökosystemen, um Bakterien mit biologischem Abbau- und Bioremediationspotenzial zu isolieren. Solche Isolate aus der Umwelt bieten eine Vielzahl von Stoffwechselwegen und Enzymen, die weiter genutzt werden können, um den Abbauprozess im industriellen Maßstab zu skalieren. In diesem Artikel skizzieren wir den allgemeinen Prozess der Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten aus aquatischen Lebensräumen und untersuchen ihre Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle in vitro mit einfachen Techniken zu nutzen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung verschiedener Bakterienarten und deren anschließende Identifizierung mittels der 16S rRNA-Analyse. Das Protokoll enthält auch Schritte zur Charakterisierung des Kohlenwasserstoffabbaupotenzials von Bakterienisolaten. Dieses Protokoll wird für Forscher nützlich sein, die versuchen, Bakterienarten aus Umwelthabitaten für ihre biotechnologischen Anwendungen zu isolieren.

Introduction

Kohlenwasserstoffe (HC) werden sowohl als Kraftstoffe als auch in chemischen Anwendungen in großem Umfang eingesetzt. Aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol und Xylol werden häufig als Lösungsmittel verwendet1. Alkene wie Ethylen und Propylen dienen als Vorläufer bei der Synthese von Polyethylen- bzw. Polypropylenpolymeren. Durch die Polymerisation eines anderen Kohlenwasserstoffs, Styrol, entsteht Polystyrol. Anthropogene Aktivitäten bringen Kohlenwasserstoffe während ihrer Produktion und ihres Transports in die Umwelt ein. Die Kontamination von Boden und Wasser durch Kohlenwasserstoffe ist für die Umwelt und die menschliche Gesundheit sehr besorgniserregend. Mikroben spielen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des Ökosystems, indem sie die biogeochemischen Kreisläufe regulieren und eine breite Palette von Substraten, zu denen auch Schadstoffe und Xenobiotika gehören, nutzen und sie in Kohlenstoff und Energiequelle umwandeln. Dieser Prozess der Entgiftung von Umweltschadstoffen durch Mikroorganismen wird als Bioremediation 3,4,5,6,7 bezeichnet.

Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe abzubauen, kommen in aquatischen und bodenständigen Lebensräumen vor 8,9,10. Es wurden viele Bakterien identifiziert, die das Potenzial haben, Alkane und aromatische HCs abzubauen, wie z. B. Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter und Oleibacter11. Die Entwicklung technologisch fortschrittlicher kulturunabhängiger Ansätze hat dazu beigetragen, neuartige HC-abbauende mikrobielle Gemeinschaften zu entdecken12. Genomisches Material, das direkt aus Quellproben isoliert wurde, wird durch Hochdurchsatzmethoden wie Next Generation Sequencing (NGS) amplifiziert und sequenziert, gefolgt von einer Analyse, so dass keine Mikroorganismen kultiviert werden müssen. NGS-Methoden, wie z. B. die Metagenomanalyse, sind teuer und leiden unter Nachteilen im Zusammenhang mit dem Amplifikationsprozess13. Kultivierungstechniken wie die selektive Anreicherungskultur14, die auf die Isolierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Mikroben abzielen, sind nach wie vor nützlich, da sie es Forschern ermöglichen, Stoffwechselwege in Bakterienisolaten zu untersuchen und zu manipulieren.

Die genomische DNA-Isolierung und die anschließende Sequenzierung des genomischen Materials liefert wertvolle Informationen über jeden Organismus. Die Sequenzierung des gesamten Genoms hilft bei der Identifizierung von Genen, die für Antibiotikaresistenzen, potenzielle Wirkstoffziele, Virulenzfaktoren, Transporter, xenobiotische metabolisierende Enzyme usw. kodieren15,16,17. Die Sequenzierung des 16SrRNA-kodierenden Gens hat sich als robuste Technik zur Identifizierung der bakteriellen Phylogenie erwiesen. Die Konservierung der Gensequenz und -funktion über die Jahre macht es zu einem zuverlässigen Werkzeug, um unbekannte Bakterien zu identifizieren und ein Isolat mit der nächstgelegenen Art zu vergleichen. Darüber hinaus ist die Länge dieses Gens optimal für die bioinformatische Analyse18. All diese Eigenschaften, zusammen mit der einfachen Genamplifikation mit universellen Primern und der Verbesserung der Gensequenzierungstechnologie, machen es zu einem Goldstandard für die Identifizierung von Mikroben.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Rückgewinnung kultivierbarer Mikroorganismen mit HC-abbauendem Potenzial aus Umweltproben. Die im Folgenden beschriebene Methode beschreibt die Sammlung und Identifizierung von HC-abbauenden Bakterien und ist in fünf Abschnitte unterteilt: (1) Sammlung von Bakterien aus Wasserproben, (2) Isolierung von Reinkulturen, (3) Untersuchung der HC-abbauenden Fähigkeit von Bakterienisolaten, (4) genomische DNA-Isolierung und (5) Identifizierung auf der Grundlage von 16S rRNA-Gensequenzierung und BLAST-Analyse. Dieses Verfahren kann zur Isolierung von Bakterien für viele verschiedene biotechnologische Anwendungen angepasst werden.

Protocol

1. Probenentnahme, -verarbeitung und -analyse HINWEIS: Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Einige der Isolate können pathogen sein, tragen Sie daher Handschuhe und desinfizieren Sie den Arbeitsbereich vor und nach dem Gebrauch. Entnehmen Sie 500 ml Wasserprobe in fünf sterilen Glasflaschen an verschiedenen Stellen des Gewässers. Messen Sie den pH-Wert und die Temperatur jeder Probe mit einem pH-Messgerät …

Representative Results

Abbildung 1 zeigt schematisch das gesamte Verfahren zur Isolierung und zum Screening von Bakterien aus aquatischen Lebensräumen und deren anschließende Identifizierung durch 16S rRNA-Analyse. Wasserproben aus einem Feuchtgebiet in Dadri, Indien, wurden in sterilen Glasflaschen gesammelt und sofort zur Verarbeitung ins Labor gebracht. Die Proben wurden durch Filterschichten mit einer Porengröße von 0,22 μm geleitet, und die Filterpapiere wurden in Kontakt mit verschiede…

Discussion

Es ist allgemein bekannt, dass nur etwa 1 % der Bakterien auf der Erde ohne weiteres im Labor kultiviert werdenkönnen 6. Selbst unter den kultivierbaren Bakterien bleiben viele uncharakterisiert. Verbesserungen in molekularen Methoden haben der Analyse und Bewertung von Bakteriengemeinschaften eine neue Dimension verliehen. Solche Techniken haben jedoch ihre Grenzen, aber sie machen die Kulturanalysen nicht überflüssig. Reinkulturtechniken zur Isolierung einzelner Bakterienarten sind nach wie v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Karthik Krishnan und den Mitgliedern des RP-Labors für ihre hilfreichen Kommentare und Anregungen. DS wird durch das SNU-Doctoral Fellowship und das Earthwatch Institute India Fellowship unterstützt. Das RP-Labor wird durch ein CSIR-EMR-Stipendium und Start-up-Mittel der Shiv Nadar University unterstützt.

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A4718 Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma-Aldrich A9434 Growth medium component
Ammonium sulphate Sigma-Aldrich A4418 Growth medium component
Bacto-Agar Millipore 1016141000 Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2) MERCK C4901-500G Growth medium component
Catechol Sigma-Aldrich 135011 Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB Sigma-Aldrich H6269 Genomic DNA Isolation
Chloroform HIMEDIA MB109 Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S5136 Growth medium component
EDTA Sigma-Aldrich E9884 gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) Sigma-Aldrich 215422 Growth medium component
Glucose Sigma-Aldrich G7021 Growth medium component
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Growth medium component; Glycerol stocks
Isopropanol HIMEDIA MB063 Genomic DNA isolation
LB Agar Difco 244520 Growth medium
Luria-Bertani (LB) Difco 244620 Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4) MERCK M2643 Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) Sigma-Aldrich 221287 Growth medium component
Nutrient Broth (NB) Merck (Millipore) 03856-500G Growth medium
Peptone Merck 91249-500G Growth medium component
Phenol Sigma-Aldrich P1037 Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786 Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Growth medium component
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2546 Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 160016235 DNA purification
QIAquick PCR Purification kit QIAGEN 163038783 DNA purification
R2A Agar Millipore 1004160500 Growth medium
SmartSpec Plus Spectrophotometer BIO-RAD 4006221 Absorbance measurement
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Genomic DNA isolation
Styrene Sigma-Aldrich S4972 Styrene biodegradation
Taq DNA Polymerase NEB M0273X 16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE) Sigma-Aldrich 93283 Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB) Merck 22092-500G Growth medium
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG Growth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) Sigma-Aldrich 221376 Growth medium component

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Sethi, D., Priyadarshini, R. Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats. J. Vis. Exp. (178), e63101, doi:10.3791/63101 (2021).

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