Isolering, förökning och identifiering av bakteriearter med kolvätemetaboliserande egenskaper från akvatiska livsmiljöer
Summary
Vi presenterar processen att isolera, sprida och karakterisera kolvätenedbrytande bakterier från akvatiska livsmiljöer. Protokollet beskriver bakteriell isolering, identifiering med 16S rRNA-metoden och testning av deras kolvätenedbrytande potential. Denna artikel skulle hjälpa forskare att karakterisera mikrobiell biologisk mångfald i miljöprover, och specifikt screena för mikrober med bioremedieringspotential.
Abstract
Kolväteföroreningar är motsträviga mot nedbrytning och deras ackumulering i miljön är giftig för alla livsformer. Bakterier kodar för många katalytiska enzymer och är naturligt kapabla att metabolisera kolväten. Forskare utnyttjar biologisk mångfald i akvatiska ekosystem för att isolera bakterier med biologisk nedbrytning och bioremedieringspotential. Sådana isolat från miljön ger en rik uppsättning metaboliska vägar och enzymer, som kan utnyttjas ytterligare för att skala upp nedbrytningsprocessen i industriell skala. I den här artikeln beskriver vi den allmänna processen för isolering, förökning och identifiering av bakteriearter från vattenlevande livsmiljöer och skärmar deras förmåga att använda kolväten som den enda kolkällan in vitro med enkla tekniker. Detta protokoll beskriver isoleringen av olika bakteriearter och deras efterföljande identifiering med hjälp av 16S rRNA-analysen. Protokollet presenterar också steg för att karakterisera kolvätenedbrytande potential hos bakterieisolat. Detta protokoll kommer att vara användbart för forskare som försöker isolera bakteriearter från miljömiljöer för deras biotekniska tillämpningar.
Introduction
Kolväten (HC) används i stor utsträckning både som bränslen och i kemiska tillämpningar. Aromatiska kolväten som bensen, toluen och xylen används i stor utsträckning som lösningsmedel1. Alkener såsom etylen och propen tjänar som prekursorer vid syntesen av polyeten- respektive polypropenpolymerer. Polymerisation av ett annat kolväte, styren bildar polystyren. Antropogena aktiviteter introducerar kolväten i miljön under produktion och transport. Kolväteförorening av mark och vatten innebär allvarliga problem för miljön och människors hälsa. Mikrober spelar en viktig roll för att upprätthålla ekosystemet genom att reglera de biogeokemiska cyklerna och utnyttja ett brett spektrum av substrat, som också inkluderar föroreningar och xenobiotika, omvandla dem till kol och energikälla. Denna process för avgiftning av miljöföroreningar av mikroorganismer är känd som bioremediering 3,4,5,6,7.
Mikroorganismer med förmåga att bryta ned kolväten finns i vatten- och markmiljöer 8,9,10. Många bakterier med potential att bryta ner alkaner och aromatiska HC har identifierats, såsom Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter och Oleibacter11. Utvecklingen av tekniskt avancerade kulturoberoende metoder har hjälpt till att upptäcka nya HC-nedbrytande mikrobiella samhällen12. Genomiskt material som isoleras direkt från källprover förstärks och sekvenseras med metoder med hög genomströmning som Next Generation Sequencing (NGS) följt av analys, vilket eliminerar behovet av att odla mikroorganismer. NGS-metoder, såsom metagenomanalys, är dyra och lider av nackdelar relaterade till förstärkningsprocessen13. Odlingstekniker som selektiv anrikningskultur14 som riktar sig mot isolering av kolvätenedbrytande mikrober är fortfarande användbara eftersom de tillåter forskare att undersöka och manipulera metaboliska vägar i bakterieisolat.
Genomisk DNA-isolering och efterföljande sekvensering av det genomiska materialet avslöjar värdefull information om vilken organism som helst. Helgenomsekvensering hjälper till att identifiera gener som kodar för antibiotikaresistens, potentiella läkemedelsmål, virulensfaktorer, transportörer, xenobiotiska-metaboliserande enzymer etc15,16,17. Sekvensering av 16SrRNA-kodande gen har visat sig vara en robust teknik för att identifiera bakteriell fylogeni. Bevarande av gensekvensen och funktionen genom åren gör det till ett pålitligt verktyg för att identifiera okända bakterier och jämföra ett isolat med de närmaste arterna. Dessutom är längden på denna gen optimal för bioinformatisk analys18. Alla dessa funktioner tillsammans med enkel genförstärkning med universella primers och förbättring av gensekvenseringsteknik gör det till en guldstandard för identifiering av mikrober.
Här beskriver vi ett förfarande för att återvinna odlingsbara mikroorganismer med HC-nedbrytande potential från miljöprover. Metoden som beskrivs nedan beskriver insamling och identifiering av HC-nedbrytande bakterier och är uppdelad i fem sektioner: (1) insamling av bakterier från vattenprover, (2) isolering av rena kulturer, (3) undersökning av HC-nedbrytande förmåga hos bakterieisolat (4) genomisk DNA-isolering och (5) identifiering baserad på 16S rRNA-gensekvensering och BLAST-analys. Denna procedur kan anpassas för att isolera bakterier för många olika biotekniska tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är väl etablerat att endast cirka 1% av bakterierna på jorden lätt kan odlas i laboratoriet6. Även bland de odlingsbara bakterierna förblir många okaraktäriserade. Förbättringar i molekylära metoder har gett en ny dimension till analys och utvärdering av bakteriesamhällen. Sådana tekniker har dock begränsningar, men de gör inte kulturanalyserna överflödiga. Rena odlingstekniker för att isolera enskilda bakteriearter förblir den primära mekanismen för karakterisering av fy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Karthik Krishnan och medlemmar i RP-labbet för deras hjälpsamma kommentarer och förslag. DS stöds av SNU-Doctoral fellowship och Earthwatch Institute India Fellowship. RP-labbet stöds av ett CSIR-EMR-bidrag och startfonder från Shiv Nadar University.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. , 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
- R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
