Vi presenterar processen att isolera, sprida och karakterisera kolvätenedbrytande bakterier från akvatiska livsmiljöer. Protokollet beskriver bakteriell isolering, identifiering med 16S rRNA-metoden och testning av deras kolvätenedbrytande potential. Denna artikel skulle hjälpa forskare att karakterisera mikrobiell biologisk mångfald i miljöprover, och specifikt screena för mikrober med bioremedieringspotential.
Kolväteföroreningar är motsträviga mot nedbrytning och deras ackumulering i miljön är giftig för alla livsformer. Bakterier kodar för många katalytiska enzymer och är naturligt kapabla att metabolisera kolväten. Forskare utnyttjar biologisk mångfald i akvatiska ekosystem för att isolera bakterier med biologisk nedbrytning och bioremedieringspotential. Sådana isolat från miljön ger en rik uppsättning metaboliska vägar och enzymer, som kan utnyttjas ytterligare för att skala upp nedbrytningsprocessen i industriell skala. I den här artikeln beskriver vi den allmänna processen för isolering, förökning och identifiering av bakteriearter från vattenlevande livsmiljöer och skärmar deras förmåga att använda kolväten som den enda kolkällan in vitro med enkla tekniker. Detta protokoll beskriver isoleringen av olika bakteriearter och deras efterföljande identifiering med hjälp av 16S rRNA-analysen. Protokollet presenterar också steg för att karakterisera kolvätenedbrytande potential hos bakterieisolat. Detta protokoll kommer att vara användbart för forskare som försöker isolera bakteriearter från miljömiljöer för deras biotekniska tillämpningar.
Kolväten (HC) används i stor utsträckning både som bränslen och i kemiska tillämpningar. Aromatiska kolväten som bensen, toluen och xylen används i stor utsträckning som lösningsmedel1. Alkener såsom etylen och propen tjänar som prekursorer vid syntesen av polyeten- respektive polypropenpolymerer. Polymerisation av ett annat kolväte, styren bildar polystyren. Antropogena aktiviteter introducerar kolväten i miljön under produktion och transport. Kolväteförorening av mark och vatten innebär allvarliga problem för miljön och människors hälsa. Mikrober spelar en viktig roll för att upprätthålla ekosystemet genom att reglera de biogeokemiska cyklerna och utnyttja ett brett spektrum av substrat, som också inkluderar föroreningar och xenobiotika, omvandla dem till kol och energikälla. Denna process för avgiftning av miljöföroreningar av mikroorganismer är känd som bioremediering 3,4,5,6,7.
Mikroorganismer med förmåga att bryta ned kolväten finns i vatten- och markmiljöer 8,9,10. Många bakterier med potential att bryta ner alkaner och aromatiska HC har identifierats, såsom Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter och Oleibacter11. Utvecklingen av tekniskt avancerade kulturoberoende metoder har hjälpt till att upptäcka nya HC-nedbrytande mikrobiella samhällen12. Genomiskt material som isoleras direkt från källprover förstärks och sekvenseras med metoder med hög genomströmning som Next Generation Sequencing (NGS) följt av analys, vilket eliminerar behovet av att odla mikroorganismer. NGS-metoder, såsom metagenomanalys, är dyra och lider av nackdelar relaterade till förstärkningsprocessen13. Odlingstekniker som selektiv anrikningskultur14 som riktar sig mot isolering av kolvätenedbrytande mikrober är fortfarande användbara eftersom de tillåter forskare att undersöka och manipulera metaboliska vägar i bakterieisolat.
Genomisk DNA-isolering och efterföljande sekvensering av det genomiska materialet avslöjar värdefull information om vilken organism som helst. Helgenomsekvensering hjälper till att identifiera gener som kodar för antibiotikaresistens, potentiella läkemedelsmål, virulensfaktorer, transportörer, xenobiotiska-metaboliserande enzymer etc15,16,17. Sekvensering av 16SrRNA-kodande gen har visat sig vara en robust teknik för att identifiera bakteriell fylogeni. Bevarande av gensekvensen och funktionen genom åren gör det till ett pålitligt verktyg för att identifiera okända bakterier och jämföra ett isolat med de närmaste arterna. Dessutom är längden på denna gen optimal för bioinformatisk analys18. Alla dessa funktioner tillsammans med enkel genförstärkning med universella primers och förbättring av gensekvenseringsteknik gör det till en guldstandard för identifiering av mikrober.
Här beskriver vi ett förfarande för att återvinna odlingsbara mikroorganismer med HC-nedbrytande potential från miljöprover. Metoden som beskrivs nedan beskriver insamling och identifiering av HC-nedbrytande bakterier och är uppdelad i fem sektioner: (1) insamling av bakterier från vattenprover, (2) isolering av rena kulturer, (3) undersökning av HC-nedbrytande förmåga hos bakterieisolat (4) genomisk DNA-isolering och (5) identifiering baserad på 16S rRNA-gensekvensering och BLAST-analys. Denna procedur kan anpassas för att isolera bakterier för många olika biotekniska tillämpningar.
Det är väl etablerat att endast cirka 1% av bakterierna på jorden lätt kan odlas i laboratoriet6. Även bland de odlingsbara bakterierna förblir många okaraktäriserade. Förbättringar i molekylära metoder har gett en ny dimension till analys och utvärdering av bakteriesamhällen. Sådana tekniker har dock begränsningar, men de gör inte kulturanalyserna överflödiga. Rena odlingstekniker för att isolera enskilda bakteriearter förblir den primära mekanismen för karakterisering av fy…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Karthik Krishnan och medlemmar i RP-labbet för deras hjälpsamma kommentarer och förslag. DS stöds av SNU-Doctoral fellowship och Earthwatch Institute India Fellowship. RP-labbet stöds av ett CSIR-EMR-bidrag och startfonder från Shiv Nadar University.
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |