細胞キラリティーを測定するためのマイクロパターニングアッセイ
Summary
我々は、マイクロパターニング技術を用いて、 インビトロで多細胞キラリティーを決定するためのプロトコルを提示する。このアッセイは、様々なタイプの細胞の左右バイアスの自動定量を可能にし、スクリーニング目的に使用することができる。
Abstract
キラリティーは固有の細胞特性であり、細胞の左右軸に沿った偏光の観点から非対称性を描写する。このユニークな特性は、発生と疾患の両方において重要な役割を担っているため、細胞のキラリティーを特徴付けるための標準化された定量化方法が研究と潜在的な用途を前進させるでしょう。このプロトコルでは、細胞のマイクロパターンアレイを利用する多細胞キラリティー特性評価アッセイについて説明します。セルラーマイクロパターンは、チタン/金コーティングされたスライドガラス上にマイクロコンタクト印刷を介して製造されます。幾何学的に定義された(例えば、リング状の)タンパク質コーティングされた島に播種した後、細胞は方向的に移動し、時計回りまたは反時計回りの方向に向かって偏ったアライメントを形成し、カスタム記述のMATLABプログラムによって自動的に分析および定量することができる。ここでは、マイクロパターン基板の作製、細胞播種、画像収集、データ解析について詳細に説明し、NIH/3T3細胞を用いて得られた代表的な結果を示す。このプロトコルは、以前に複数の公表された研究で検証されており、 インビトロで細胞キラリティを研究するための効率的で信頼性の高いツールです。
Introduction
細胞の左右(LR)非対称性は、細胞利きまたはキラリティーとしても知られており、LR軸における細胞極性を記述し、基本的で保存された生物物理学的特性であると認識されている1、2、3、4、5。細胞キラリティーは、インビボおよびインビトロの両方で複数のスケールで観察されている。以前の発見は、円形の島6に播種された単一細胞におけるアクチン細胞骨格のキラル旋回、閉じ込められた境界7、8、9、10、11内の細胞の偏った遊走および整列、およびニワトリヒートチューブ12の非対称ループを明らかにした。
多細胞レベルでは、細胞キラリティーは、指向性遊走または整列、細胞回転、細胞骨格ダイナミクス、および細胞小器官位置決め7、8、9、10、11、12、13から決定することができる。我々は、接着細胞7、8、9、10のキラルバイアスを効率的に特徴付けるために、マイクロパターニングベースの14アッセイを確立した。リング状のマイクロパターンが細胞集塊を幾何学的に閉じ込めると、細胞は集合的に方向移動と偏った整列を示す。リングの位相コントラスト画像で細胞の位置合わせを自動的に検出して測定するために、MATLABプログラムが開発されました。局所的なセルアライメントの方向は、円周方向からの偏差に応じて、偏った角度で定量化されます。統計解析の結果、セルのリングパターンは反時計回り(CCW)バイアスまたは時計回り(CW)バイアスのいずれかとして指定されます。
このアッセイは、複数の細胞表現型のキラリティーを特徴付けるために使用され(表1)、細胞のLR非対称性は表現型特異的であることが見出されている7、11、15。さらに、アクチンのダイナミクスおよび形態学の破壊は、キラルバイアス7,8の逆転をもたらし得、酸化ストレスは、同様に細胞キラリティを変化させる可能性がある9。手順の単純さとアプローチ7、8、9、10の堅牢性のために、この2Dキラリティーアッセイは、インビトロで多細胞キラリティを決定および研究するための効率的で信頼性の高いツールを提供します。
このプロトコルの目的は、細胞キラリティを特徴付けるためのこの方法の使用を実証することである。このプロトコルは、マイクロコンタクト印刷技術を介してパターン化されたセルラーアレイを作製し、MATLABプログラムを使用して自動化された方法でキラリティ分析を行う方法を記述しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するリング状のパターニングアッセイは、多細胞キラリティの定量的特性評価のための使いやすいツールを提供し、信頼性と再現性の高い結果を生み出すことができます。同一の定義済みマイクロ環境の迅速な生成と偏りのない分析により、大容量サンプルの自動ハイスループット処理が可能になります。このプロトコルでは、リングマイクロパターンの作成、セルパターニング?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(OD/NICHD DP2HD083961およびNHBLI R01HL148104)から資金提供を受けた。レオ・Q・ワンは、ピュー慈善信託の支援を受けている生物医学科学(PEW 00026185)のピュー奨学生です。Haokang Zhangは、American Heart Association Predoctoral Fellowship(20PRE35210243)の支援を受けています。
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
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