Ein Mikrostrukturierungsassay zur Messung der Zellchiralität
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Bestimmung der multizellulären Chiralität in vitro unter Verwendung der Mikrostrukturierungstechnik. Dieser Assay ermöglicht die automatische Quantifizierung der Links-Rechts-Verzerrungen verschiedener Zelltypen und kann für Screening-Zwecke verwendet werden.
Abstract
Chiralität ist eine intrinsische zelluläre Eigenschaft, die die Asymmetrie in Bezug auf die Polarisation entlang der Links-Rechts-Achse der Zelle darstellt. Da diese einzigartige Eigenschaft aufgrund ihrer wichtigen Rolle sowohl bei der Entwicklung als auch bei der Krankheit zunehmend Aufmerksamkeit erregt, würde eine standardisierte Quantifizierungsmethode zur Charakterisierung der Zellchiralität die Forschung und mögliche Anwendungen vorantreiben. In diesem Protokoll beschreiben wir einen multizellulären Chiralitätscharakterisierungsassay, der mikrostrukturierte Zellarrays verwendet. Zelluläre Mikromuster werden auf titan/vergoldeten Glasobjektträgern mittels Mikrokontaktdruck hergestellt. Nach der Aussaat auf den geometrisch definierten (z. B. ringförmigen), proteinbeschichteten Inseln wandern die Zellen in direktionale Richtung und bilden eine verzerrte Ausrichtung entweder im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn, die automatisch analysiert und quantifiziert werden kann durch ein speziell geschriebenes MATLAB-Programm. Hier beschreiben wir detailliert die Herstellung von mikrostrukturierten Substraten, Zellaussaat, Bilderfassung und Datenanalyse und zeigen repräsentative Ergebnisse, die mit den NIH/3T3-Zellen erzielt wurden. Dieses Protokoll wurde zuvor in mehreren veröffentlichten Studien validiert und ist ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung der Zellchiralität in vitro.
Introduction
Die Links-Rechts-Asymmetrie (LR) der Zelle, auch bekannt als zelluläre Händigkeit oder Chiralität, beschreibt die Zellpolarität in der LR-Achse und wird als grundlegende, konservierte, biophysikalische Eigenschaft 1,2,3,4,5 anerkannt. Die Zellchiralität wurde sowohl in vivo als auch in vitro auf mehreren Skalen beobachtet. Frühere Ergebnisse zeigten chirale Verwirbelung des Aktin-Zytoskeletts in einzelnen Zellen, die auf kreisförmigen Inselnausgesät waren 6, verzerrte Migration und Ausrichtung von Zellen innerhalb begrenzter Grenzen 7,8,9,10,11 und asymmetrische Schleife der Hühnerwärmeröhre 12.
Auf der multizellulären Ebene kann die Zellchiralität durch gerichtete Migration oder Ausrichtung, Zellrotation, Zytoskelettdynamik und Zellorganellenpositionierung 7,8,9,10,11,12,13 bestimmt werden. Wir haben einen mikrostrukturbasierten14-Assay etabliert, um die chirale Verzerrung adhärenter Zellen 7,8,9,10 effizient zu charakterisieren. Mit den ringförmigen Mikromustern, die Zellcluster geometrisch einschließen, weisen die Zellen zusammen eine gerichtete Migration und eine verzerrte Ausrichtung auf. Ein MATLAB-Programm wurde entwickelt, um die Zellausrichtung in Phasenkontrastbildern des Rings automatisch zu erkennen und zu messen. Die Richtung der lokalen Zellausrichtung wird mit einem vorgespannten Winkel quantifiziert, abhängig von ihrer Abweichung von der Umfangsrichtung. Nach der statistischen Analyse wird das Ringmuster der Zellen entweder als gegen den Uhrzeigersinn (CCW) Verzerrungen oder im Uhrzeigersinn (CW) als Verzerrungen bezeichnet.
Dieser Assay wurde verwendet, um die Chiralität mehrerer Zellphänotypen zu charakterisieren (Tabelle 1), und die LR-Asymmetrie von Zellen wurde als phänotypspezifisch 7,11,15 befunden. Darüber hinaus kann eine Störung der Aktindynamik und -morphologie zu einer Umkehrung der chiralen Verzerrungführen 7,8, und oxidativer Stress kann auch die Zellchiralität verändern9. Aufgrund der Einfachheit des Verfahrens und der Robustheit des Ansatzes 7,8,9,10 bietet dieser 2D-Chiralitätsassay ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug zur Bestimmung und Untersuchung der multizellulären Chiralität in vitro.
Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Verwendung dieser Methode zur Charakterisierung der Zellchiralität zu demonstrieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie gemusterte zelluläre Arrays über die Mikrokontaktdrucktechnik hergestellt und Chiralitätsanalysen automatisiert mit dem MATLAB-Programm durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hier beschriebene ringförmige Musterungsassay bietet ein einfach zu bedienendes Werkzeug zur quantitativen Charakterisierung der multizellulären Chiralität, das in der Lage ist, äußerst zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse zu erzielen. Die schnelle Generierung identisch definierter Mikroumgebungen und die unvoreingenommene Analyse ermöglichen eine automatisierte Hochdurchsatzverarbeitung großer Proben. Dieses Protokoll diskutiert die Herstellung der Ringmikromuster, die Zellstrukturierung und die automat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (OD / NICHD DP2HD083961 und NHBLI R01HL148104) finanziert. Leo Q. Wan ist Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), unterstützt von den Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang wird durch das American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243) unterstützt.
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
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