Un ensayo de micropatrones para medir la quiralidad celular
Summary
Presentamos un protocolo para determinar la quiralidad multicelular in vitro, utilizando la técnica de micropatronaje. Este ensayo permite la cuantificación automática de los sesgos izquierda-derecha de varios tipos de células y se puede utilizar con fines de detección.
Abstract
La quiralidad es una propiedad celular intrínseca, que representa la asimetría en términos de polarización a lo largo del eje izquierda-derecha de la célula. Como esta propiedad única atrae cada vez más atención debido a sus importantes funciones tanto en el desarrollo como en la enfermedad, un método de cuantificación estandarizado para caracterizar la quiralidad celular avanzaría en la investigación y las aplicaciones potenciales. En este protocolo, describimos un ensayo de caracterización de quiralidad multicelular que utiliza matrices de células con micropatrones. Los micropatrones celulares se fabrican en portaobjetos de vidrio recubiertos de titanio / oro a través de la impresión de microcontacto. Después de la siembra en las islas geométricamente definidas (por ejemplo, en forma de anillo) recubiertas de proteínas, las células migran direccionalmente y forman una alineación sesgada hacia la dirección en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj, que puede analizarse y cuantificarse automáticamente mediante un programa MATLAB escrito a medida. Aquí describimos en detalle la fabricación de sustratos micropatronados, la siembra celular, la recopilación de imágenes y el análisis de datos y mostramos resultados representativos obtenidos utilizando las células NIH/3T3. Este protocolo ha sido validado previamente en múltiples estudios publicados y es una herramienta eficiente y fiable para estudiar la quiralidad celular in vitro.
Introduction
La asimetría izquierda-derecha (LR) de la célula, también conocida como mano celular o quiralidad, describe la polaridad celular en el eje LR y se reconoce que es una propiedad biofísica fundamental y conservada 1,2,3,4,5. La quiralidad celular se ha observado tanto in vivo como in vitro a múltiples escalas. Hallazgos previos revelaron remolinos quirales de citoesqueleto de actina en células individuales sembradas en islas circulares6, migración sesgada y alineación de células dentro de límites confinados 7,8,9,10,11 y bucle asimétrico del tubo de calor de pollo 12.
A nivel multicelular, la quiralidad celular se puede determinar a partir de la migración o alineación direccional, la rotación celular, la dinámica citoesquelética y el posicionamiento de orgánuloscelulares 7,8,9,10,11,12,13. Hemos establecido un ensayo basado en micropatrones14 para caracterizar eficientemente el sesgo quiral de las células adherentes 7,8,9,10. Con los micropatrones en forma de anillo confinando geométricamente los grupos celulares, las células exhiben colectivamente migración direccional y alineación sesgada. Se desarrolló un programa MATLAB para detectar y medir automáticamente la alineación celular en imágenes de contraste de fase del anillo. La dirección de la alineación celular local se cuantifica con un ángulo sesgado, dependiendo de su desviación de la dirección circunferencial. Después del análisis estadístico, el patrón de anillo de las células se designa como sesgos en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) o sesgos en el sentido de las agujas del reloj (CW).
Este ensayo se ha utilizado para caracterizar la quiralidad de fenotipos celulares múltiples (Tabla 1), y se ha encontrado que la asimetría LR de las células es específica del fenotipo 7,11,15. Además, la interrupción de la dinámica y la morfología de la actina puede resultar en una reversión del sesgo quiral 7,8, y el estrés oxidativo también puede alterar la quiralidad celular9. Debido a la simplicidad del procedimiento y la robustez del enfoque 7,8,9,10, este ensayo de quiralidad 2D proporciona una herramienta eficiente y confiable para determinar y estudiar la quiralidad multicelular in vitro.
El propósito de este protocolo es demostrar el uso de este método para caracterizar la quiralidad celular. Este protocolo describe cómo fabricar matrices celulares con patrones a través de la técnica de impresión de microcontacto y realizar análisis de quiralidad de forma automatizada utilizando el programa MATLAB.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de patrones en forma de anillo descrito aquí proporciona una herramienta fácil de usar para la caracterización cuantitativa de la quiralidad multicelular, capaz de producir resultados altamente confiables y repetibles. La rápida generación de microambientes definidos idénticos y el análisis imparcial permiten el procesamiento automatizado de alto rendimiento de muestras de gran tamaño. Este protocolo discute la fabricación de los micropatrones de anillo, el modelado celular y el análisis automático d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (OD/NICHD DP2HD083961 y NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan es un Pew Scholar en Ciencias Biomédicas (PEW 00026185), apoyado por Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang cuenta con el apoyo de la American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer’s disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021)
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
