Et mikromønsteranalyse til måling af cellechiralitet
Summary
Vi præsenterer en protokol til bestemmelse af multicellulær chiralitet in vitro ved hjælp af mikromønsterteknikken. Dette assay giver mulighed for automatisk kvantificering af venstre-højre bias af forskellige typer celler og kan bruges til screeningsformål.
Abstract
Chiralitet er en iboende cellulær egenskab, som skildrer asymmetrien med hensyn til polarisering langs cellens venstre-højre akse. Da denne unikke egenskab tiltrækker stigende opmærksomhed på grund af sine vigtige roller i både udvikling og sygdom, ville en standardiseret kvantificeringsmetode til karakterisering af cellechiralitet fremme forskning og potentielle anvendelser. I denne protokol beskriver vi et multicellulært chiralitetskarakteriseringsassay, der bruger mikromønstrede arrays af celler. Cellulære mikromønstre fremstilles på titanium / guldbelagte glasrutschebaner via mikrokontaktudskrivning. Efter såning på de geometrisk definerede (f.eks. Ringformede), proteinbelagte øer, migrerer celler retningsbestemt og danner en forudindtaget justering mod enten uret eller mod uret retning, som automatisk kan analyseres og kvantificeres ved hjælp af et specialskrevet MATLAB-program. Her beskriver vi detaljeret fremstillingen af mikromønstrede substrater, cellesåning, billedindsamling og dataanalyse og viser repræsentative resultater opnået ved hjælp af NIH / 3T3-cellerne. Denne protokol er tidligere blevet valideret i flere offentliggjorte undersøgelser og er et effektivt og pålideligt værktøj til at studere cellechiralitet in vitro.
Introduction
Venstre-højre (LR) asymmetri af cellen, også kendt som cellulær handedness eller chiralitet, beskriver cellepolariteten i LR-aksen og anerkendes som en grundlæggende, bevaret, biofysisk egenskab 1,2,3,4,5. Cellechiralitet er blevet observeret både in vivo og in vitro på flere skalaer. Tidligere resultater afslørede chiral hvirvlen af actincytoskelet i enkeltceller podet på cirkulære øer6, forudindtaget migration og justering af celler inden for begrænsede grænser 7,8,9,10,11 og asymmetrisk looping af kyllingevarmerør12.
På det multicellulære niveau kan cellechiralitet bestemmes ud fra retningsbestemt migration eller justering, cellulær rotation, cytoskeletal dynamik og celleorganelpositionering 7,8,9,10,11,12,13. Vi har etableret et mikromønsterbaseret14 assay for effektivt at karakterisere den chirale bias af klæbende celler 7,8,9,10. Med de ringformede mikromønstre, der geometrisk begrænser celleklynger, udviser cellerne kollektivt retningsbestemt migration og forudindtaget justering. Et MATLAB-program blev udviklet til automatisk at registrere og måle cellejustering i fasekontrastbilleder af ringen. Retningen af lokal cellejustering kvantificeres med en forspændt vinkel afhængigt af dens afvigelse fra omkredsretningen. Efter statistisk analyse betegnes cellernes ringmønster enten som CCW-forstyrrelser (mod uret) eller med uret (CW) forstyrrelser.
Dette assay er blevet brugt til at karakterisere chiraliteten af flere cellefænotyper (tabel 1),og LR-asymmetrien af celler har vist sig at være fænotypespecifik 7,11,15. Desuden kan forstyrrelse af aktindynamik og morfologi resultere i en reversering af chiral bias 7,8, og oxidativ stress kan også ændre cellechiralitet9. På grund af procedurens enkelhed og robustheden af tilgangen 7,8,9,10 giver dette 2D-chiralitetsassay et effektivt og pålideligt værktøj til bestemmelse og undersøgelse af multicellulær chiralitet in vitro.
Formålet med denne protokol er at demonstrere brugen af denne metode til at karakterisere cellechiralitet. Denne protokol beskriver, hvordan man fremstiller mønstrede cellulære arrays via mikrokontaktudskrivningsteknik og udfører chiralitetsanalyse på en automatiseret måde ved hjælp af MATLAB-programmet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det ringformede mønsterassay, der er beskrevet her, giver et brugervenligt værktøj til kvantitativ karakterisering af multicellulær chiralitet, der er i stand til at producere meget pålidelige og repeterbare resultater. Hurtig generering af identiske definerede mikromiljøer og upartisk analyse muliggør automatiseret behandling med høj kapacitet af store størrelser af prøver. Denne protokol diskuterer fremstillingen af ringmikromønstrene, cellemønster og automatisk analyse af den forudindtagede cellejustering …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (OD / NICHD DP2HD083961 og NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan er en Pew Scholar i Biomedicinsk Videnskab (PEW 00026185), støttet af Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang støttes af American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer’s disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021)
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
