सेल Chirality को मापने के लिए एक Micropatterning परख
Summary
हम माइक्रोपैटर्निंग तकनीक का उपयोग करके विट्रो में बहुकोशिकीय चिरलता का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस परख कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के बाएं-दाएं पूर्वाग्रहों के स्वचालित परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है और स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
चिरलता एक आंतरिक सेलुलर संपत्ति है, जो सेल के बाएं-दाएं अक्ष के साथ ध्रुवीकरण के संदर्भ में विषमता को दर्शाती है। चूंकि यह अद्वितीय संपत्ति विकास और बीमारी दोनों में अपनी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण बढ़ते ध्यान को आकर्षित करती है, इसलिए सेल चिरलता की विशेषता के लिए एक मानकीकृत परिमाणीकरण विधि अनुसंधान और संभावित अनुप्रयोगों को आगे बढ़ाएगी। इस प्रोटोकॉल में, हम एक बहुकोशिकीय chirality लक्षण वर्णन परख है कि कोशिकाओं के micropatterned सरणियों का उपयोग करता है का वर्णन. सेलुलर माइक्रोपैटर्न को माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के माध्यम से टाइटेनियम / गोल्ड-लेपित ग्लास स्लाइड पर बनाया जाता है। ज्यामितीय रूप से परिभाषित (जैसे, अंगूठी के आकार के), प्रोटीन-लेपित द्वीपों पर सीडिंग के बाद, कोशिकाएं दिशात्मक रूप से माइग्रेट होती हैं और दक्षिणावर्त या वामावर्त दिशा की ओर एक पक्षपाती संरेखण बनाती हैं, जिसे स्वचालित रूप से एक कस्टम-लिखित MATLAB प्रोग्राम द्वारा विश्लेषण और परिमाणित किया जा सकता है। यहां हम माइक्रोपैटर्न्ड सब्सट्रेट्स, सेल सीडिंग, छवि संग्रह और डेटा विश्लेषण के निर्माण का विस्तार से वर्णन करते हैं और एनआईएच / 3 टी 3 कोशिकाओं का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल को पहले कई प्रकाशित अध्ययनों में मान्य किया गया है और विट्रो में सेल चिरलिटी का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण है।
Introduction
सेल के बाएं-दाएं (एलआर) विषमता, जिसे सेलुलर हैंडनेस या चिरलिटी के रूप में भी जाना जाता है, एलआर अक्ष में सेल ध्रुवीयता का वर्णन करता है और इसे एक मौलिक, संरक्षित, बायोफिजिकल संपत्ति 1,2,3,4,5 माना जाता है। सेल chirality विवो और इन विट्रो दोनों में कई पैमाने पर देखा गया है। पिछले निष्कर्षों से पता चला कि परिपत्रद्वीपों 6 पर सीडेड एकल कोशिकाओं में एक्टिन साइटोस्केलेटन के चिरल घूमते हुए, पक्षपाती प्रवास और सीमित सीमाओं के भीतर कोशिकाओं का संरेखण 7,8,9,10,11, और चिकन हीट ट्यूब12 के विषम लूपिंग।
बहुकोशिकीय स्तर पर, सेल चिरलता को दिशात्मक प्रवास या संरेखण, सेलुलर रोटेशन, साइटोस्केलेटल गतिशीलता और सेल ऑर्गेनेल पोजिशनिंग 7,8,9,10,11,12,13 से निर्धारित किया जा सकता है। हम एक micropatterning आधारित 14 परख की स्थापना की है कुशलतापूर्वक अनुयायी कोशिकाओं के चिरल पूर्वाग्रह 7,8,9,10 की विशेषता है. रिंग के आकार के माइक्रोपैटर्न ज्यामितीय रूप से सीमित सेल क्लस्टर के साथ, कोशिकाएं सामूहिक रूप से दिशात्मक प्रवास और पक्षपाती संरेखण का प्रदर्शन करती हैं। एक MATLAB कार्यक्रम स्वचालित रूप से पता लगाने और अंगूठी के चरण-विपरीत छवियों में सेल संरेखण को मापने के लिए विकसित किया गया था। स्थानीय सेल संरेखण की दिशा को एक पक्षपाती कोण के साथ परिमाणित किया जाता है, जो परिधीय दिशा से इसके विचलन पर निर्भर करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद, कोशिकाओं के रिंग पैटर्न को या तो वामावर्त (सीसीडब्ल्यू) पूर्वाग्रहों या दक्षिणावर्त (सीडब्ल्यू) पूर्वाग्रहों के रूप में नामित किया जाता है।
इस परख का उपयोग कई सेल फेनोटाइप (तालिका 1) की चिरलता को चिह्नित करने के लिए किया गया है, और कोशिकाओं की एलआर विषमता को फेनोटाइप-विशिष्ट 7,11,15 पाया गया है। इसके अलावा, एक्टिन गतिशीलता और आकृति विज्ञान में व्यवधान के परिणामस्वरूप चिरल पूर्वाग्रह 7,8 के उलट हो सकते हैं, और ऑक्सीडेटिव तनाव सेल चिरलिटी को भी बदल सकता है। प्रक्रिया की सादगी औरदृष्टिकोण की मजबूती के कारण 7,8,9,10, यह 2 डी chirality परख निर्धारित करने और विट्रो में बहुकोशिकीय chirality का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सेल चिरलता को चिह्नित करने के लिए इस विधि के उपयोग को प्रदर्शित करना है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग तकनीक के माध्यम से पैटर्न वाले सेलुलर सरणियों को कैसे बनाया जाए और MATLAB प्रोग्राम का उपयोग करके स्वचालित फैशन में चिरलिटी विश्लेषण किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित अंगूठी के आकार के पैटर्निंग परख बहुकोशिकीय chirality के मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक आसान करने के लिए उपयोग उपकरण प्रदान करता है, अत्यधिक विश्वसनीय और repeatable परिणामों का उत्पादन करने में सक्षम…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (OD / NICHD DP2HD083961 और NHBLI R01HL148104) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लियो क्यू वान बायोमेडिकल साइंसेज (PEW 00026185) में एक प्यू स्कॉलर है, जो प्यू चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित है। हाओकांग झांग अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन प्रीडॉक्टोरल फैलोशिप (20PRE35210243) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
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