Een micropatterning-test voor het meten van celchiraliteit
Summary
We presenteren een protocol voor het bepalen van meercellige chiraliteit in vitro, met behulp van de micropatterning-techniek. Deze test maakt automatische kwantificering van de links-rechts vooroordelen van verschillende soorten cellen mogelijk en kan worden gebruikt voor screeningsdoeleinden.
Abstract
Chiraliteit is een intrinsieke cellulaire eigenschap, die de asymmetrie weergeeft in termen van polarisatie langs de links-rechts as van de cel. Omdat deze unieke eigenschap steeds meer aandacht trekt vanwege zijn belangrijke rol in zowel ontwikkeling als ziekte, zou een gestandaardiseerde kwantificeringsmethode voor het karakteriseren van celchiraliteit onderzoek en potentiële toepassingen bevorderen. In dit protocol beschrijven we een meercellige chiraliteitskarakteriseringstest die gebruik maakt van microgepatterde arrays van cellen. Cellulaire micropatronen worden vervaardigd op titanium / goud gecoate glasplaten via microcontactprinten. Na het zaaien op de geometrisch gedefinieerde (bijv. ringvormige), eiwit-gecoate eilanden, migreren cellen richtingsgewijs en vormen een bevooroordeelde uitlijning naar de klok mee of de tegen de klok in richting, die automatisch kan worden geanalyseerd en gekwantificeerd door een op maat geschreven MATLAB-programma. Hier beschrijven we in detail de fabricage van microgepatterde substraten, celzaaien, beeldverzameling en gegevensanalyse en tonen we representatieve resultaten verkregen met behulp van de NIH / 3T3-cellen. Dit protocol is eerder gevalideerd in meerdere gepubliceerde studies en is een efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van celchiraliteit in vitro.
Introduction
Links-rechts (LR) asymmetrie van de cel, ook bekend als cellulaire handvaardigheid of chiraliteit, beschrijft de celpolariteit in de LR-as en wordt erkend als een fundamentele, geconserveerde, biofysische eigenschap 1,2,3,4,5. Celchiraliteit is zowel in vivo als in vitro op meerdere schalen waargenomen. Eerdere bevindingen onthulden chirale werveling van actinecytoskelet in enkele cellen gezaaid op cirkelvormige eilanden6, bevooroordeelde migratie en uitlijning van cellen binnen begrensde grenzen 7,8,9,10,11 en asymmetrische lusing van kippenwarmtebuis 12.
Op meercellig niveau kan celchiraliteit worden bepaald aan de hand van directionele migratie of uitlijning, cellulaire rotatie, cytoskeletale dynamica en celorganelpositionering 7,8,9,10,11,12,13. We hebben een op micropatterning gebaseerde14-assay opgesteld om de chirale bias van aanhangende cellen efficiënt te karakteriseren 7,8,9,10. Met de ringvormige micropatronen die celclusters geometrisch beperken, vertonen de cellen gezamenlijk directionele migratie en bevooroordeelde uitlijning. Er is een MATLAB-programma ontwikkeld om automatisch de celuitlijning te detecteren en te meten in fasecontrastbeelden van de ring. De richting van de lokale celuitlijning wordt gekwantificeerd met een bevooroordeelde hoek, afhankelijk van de afwijking van de omtrekrichting. Na statistische analyse wordt het ringpatroon van cellen aangeduid als contraklokkend (CCW) biases of met de klok mee (CW) biases.
Deze test is gebruikt om de chiraliteit van meerdere celfenotypen te karakteriseren (tabel 1) en de LR-asymmetrie van cellen is fenotypespecifiekgebleken 7,11,15. Bovendien kan verstoring van de actinedynamica en morfologie resulteren in een omkering van chirale bias 7,8, en oxidatieve stress kan ook de celchiraliteit veranderen9. Vanwege de eenvoud van de procedure en de robuustheid van de benadering 7,8,9,10, biedt deze 2D-chiraliteitstest een efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor het bepalen en bestuderen van meercellige chiraliteit in vitro.
Het doel van dit protocol is om het gebruik van deze methode aan te tonen om celchiraliteit te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe patroon cellulaire arrays kunnen worden vervaardigd via microcontactdruktechniek en chiraliteitsanalyses op een geautomatiseerde manier kunnen worden uitgevoerd met behulp van het MATLAB-programma.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ringvormige patroontest die hier wordt beschreven, biedt een eenvoudig te gebruiken hulpmiddel voor kwantitatieve karakterisering van meercellige chiraliteit, in staat om zeer betrouwbare en herhaalbare resultaten te produceren. Snelle generatie van identieke gedefinieerde micro-omgevingen en onbevooroordeelde analyse maakt geautomatiseerde high-throughput verwerking van grote hoeveelheden monsters mogelijk. Dit protocol bespreekt de fabricage van de ringmicropatronen, celpatronen en automatische analyse van de bevoor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 en NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan is een Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), ondersteund door de Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang wordt ondersteund door american heart association predoctoral fellowship (20PRE35210243).
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer’s disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021)
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
