Cellulære membranaffinitetskromatografikolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B

Summary

Protokollen beskriver fremstillingen af cellemembranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner med immobiliserede cellemembranfragmenter indeholdende funktionelle transmembrantropomyosinkinasereceptor B-proteiner. Anvendelsen af CMAC-kolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med disse receptorer og er til stede i komplekse naturlige blandinger, forklares også.

Abstract

Kemikalier syntetiseret af planter, svampe, bakterier og marine hvirvelløse dyr har været en rig kilde til nye lægemiddelhits og bly. Lægemidler som statiner, penicillin, paclitaxel, rapamycin eller artemisinin, der almindeligvis anvendes i medicinsk praksis, er først blevet identificeret og isoleret fra naturlige produkter. Identifikation og isolering af biologisk aktive specialiserede metabolitter fra naturlige kilder er imidlertid en udfordrende og tidskrævende proces. Traditionelt isoleres og renses individuelle metabolitter fra komplekse blandinger efter ekstraktion af biomasse. Derefter testes de isolerede molekyler i funktionelle assays for at verificere deres biologiske aktivitet. Her præsenterer vi brugen af cellulære membranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner til at identificere biologisk aktive forbindelser direkte fra komplekse blandinger. CMAC-kolonner giver mulighed for identifikation af forbindelser, der interagerer med immobiliserede funktionelle transmembranproteiner (TMP’er) indlejret i deres oprindelige phospholipid-dobbeltlagsmiljø. Dette er en målrettet tilgang, som kræver, at man kender den TMP, hvis aktivitet man har til hensigt at modulere med den nyligt identificerede lægemiddelkandidat til små molekyler. I denne protokol præsenterer vi en tilgang til at forberede CMAC-kolonner med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B (TrkB), som har vist sig som et levedygtigt mål for lægemiddelopdagelse for adskillige nervesystemforstyrrelser. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til at samle CMAC-kolonnen med immobiliserede TrkB-receptorer ved hjælp af neuroblastomcellelinjer, der overudtrykker TrkB-receptorer. Vi præsenterer yderligere tilgangen til at undersøge kolonnens funktionalitet og dens anvendelse til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med TrkB-receptorer.

Introduction

Botaniske blandinger er rige på farmakologisk aktive forbindelser¹, der tjener som en god kilde til identifikation af nye lægemiddelhits og fører ^2,3,4,5. Opdagelsen af nye lægemidler fra naturlige produkter har været en frugtbar tilgang, og mange aktuelt godkendte lægemidler stammer fra forbindelser, der først blev identificeret i naturen. Den kemiske mangfoldighed af naturlige forbindelser er svær at matche af menneskeskabte biblioteker af kemisk syntetiserede molekyler. Mange naturlige forbindelser interagerer med og modulerer humane proteinmål og kan betragtes som evolutionært optimerede lægemiddellignende molekyler⁶. Disse naturlige forbindelser er særligt velegnede til identifikation af lægemiddellende til brug ved neurologiske lidelser⁶. To af de i øjeblikket FDA-godkendte lægemidler til behandling af Alzheimers sygdom (AD) er afledt af naturlige alkaloider, nemlig: galantamin og rivastigmin (et derivat af physostigmin)⁶. L-DOPA, i øjeblikket det mest almindeligt foreskrevne lægemiddel til Parkinsons sygdom, blev først identificeret fra den brede bønne (Vicia faba L.) ⁷. Pergolid og lisurid, dopaminerge receptoragonister er derivaterne af naturlige ergotalkaloider fra den parasitære svamp Claviceps purpurea⁸. Reserpin, et alkaloid isoleret fra indisk slangerod (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var et af de første antipsykotiske lægemidler⁹. For nylig har dysreguleret immunrespons og systemisk inflammation været forbundet med udviklingen af adskillige neurologiske lidelser, såsom større depressiv lidelse eller neurodegenerative sygdomme¹⁰. En plantebaseret kost sammen med andre livsstilsinterventioner har vist sig at forbedre kognitive og funktionelle evner hos ældre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Visse elektrofile molekyler, der tilhører triterpener og polyfenoler, har vist sig at modulere inflammatoriske reaktioner i både in vitro– og in vivo-modeller ¹². For eksempel interfererer naturlige forbindelser indeholdende α.β-umættet carbonyl (f.eks. Curcumin, cinnamaldehyd) eller isothiocyanatgruppe (f.eks. Sulforafan) med Toll-lignende receptor-4 (TLR4) dimerisering, der hæmmer nedstrømssyntesen af proinflammatoriske cytokiner i en murininterleukin-3-afhængig pro-B-cellelinje^12,22 . Epidemiologisk dokumentation peger stærkt på, at fytokemikalier i kosten, der findes i komplekse fødevarematricer, også kan udgøre en levedygtig kilde til nye lægemiddelledninger⁶.

En af de største hindringer for identifikationen af biologisk aktive molekyler i planteekstrakter, herunder plantebaserede fødevarer, er kompleksiteten af de undersøgte prøver. Traditionelt isoleres, renses de enkelte forbindelser og testes efterfølgende for biologisk aktivitet. Denne tilgang fører normalt til identifikation af de mest rigelige og velkarakterierede forbindelser. Fænotypiske lægemiddelopdagelsesmetoder uden et defineret molekylært mål er afhængige af biostyret fraktionering af komplekse blandinger²³. I denne fremgangsmåde fraktioneres et ekstrakt i mindre komplekse underfraktioner, der efterfølgende testes i fænotypiske assays. Isolering og oprensning af aktive forbindelser styres af biologisk aktivitet verificeret i assayet. Kendskabet til identiteten af et specificeret lægemiddelmål kan i væsentlig grad fremskynde identifikationen af farmakologisk aktive forbindelser, der er til stede i komplekse blandinger. Disse tilgange er normalt baseret på immobilisering af det molekylære mål, for eksempel et enzym, på en fast overflade, som magnetiske perler²³. De immobiliserede mål anvendes efterfølgende i screeningsforsøgene, hvilket resulterer i isolering af forbindelser, der interagerer med målet. Mens denne tilgang i vid udstrækning er blevet anvendt til identifikation af forbindelser rettet mod cytosoliske proteiner, er den blevet mindre almindeligt anvendt til identifikation af kemikalier, der interagerer med transmembranproteiner (TMP’er)²³. En yderligere udfordring i immobiliseringen af TMP’er stammer fra det faktum, at proteinets aktivitet afhænger af dets interaktion med cellemembranphospholipider og andre molekyler i dobbeltlagstoget, såsom kolesterol^23,24. Det er vigtigt at bevare disse subtile interaktioner mellem proteiner og deres oprindelige phospholipid dobbeltlagsmiljø, når man forsøger at immobilisere transmembranmålet.

I cellulær membranaffinitetskromatografi (CMAC) immobiliseres cellemembranfragmenter og ikke oprensede proteiner på de stationære fasepartikler af kunstig membran (IAM)²³. IAM stationære faser fremstilles ved kovalent binding af phosphatidylcholinanaloger på silica. For nylig er der udviklet nye klasser af IAM stationære faser, hvor frie amin- og silanolgrupper er ende-capped (IAM. Personlig computer. DD2 partikler). Under CMAC-kolonnernes forberedelse immobiliseres cellemembranfragmenter på overfladen af IAM-partikler gennem adsorption.

CMAC-kolonner er blevet brugt til dato til at immobilisere forskellige klasser af TMP’er, herunder ionkanaler (f.eks. Nikotinreceptorer), GPCR’er (f.eks. Opioidreceptorer), proteintransportører (f.eks. P-glycoprotein) ^osv.24. De immobiliserede proteinmål er blevet anvendt til karakterisering af farmakodynamik (f.eks. dissociationskonstant, Kd) eller bestemmelse af bindingskinetik (k_on og k_off) af små molekyleligander, der interagerer med målet, samt i processen med identifikation af potentielle nye lægemiddelledninger, der er til stede i komplekse matricer²⁴ . Her præsenterer vi forberedelsen af CMAC-kolonner med den immobiliserede tropomyosinkinasereceptor B (TrkB), som har vist sig som et levedygtigt mål for lægemiddelopdagelse for adskillige nervesystemforstyrrelser.

Tidligere undersøgelser viste, at aktiveringen af den hjerneafledte neurotrofiske faktor (BDNF) / TrkB-vej er forbundet med forbedring af visse neurologiske lidelser, såsom AD eller større depressiv lidelse 25,26,27,28. Det blev rapporteret, at BDNF-niveauer og dets receptor TrkB-ekspression falder i AD, og lignende reduktioner forringer hippocampus funktion i dyremodeller af AD²⁹. Nedsatte niveauer af BDNF blev rapporteret i serum og hjerne hos AD-patienter 30,31,32. Tau-overekspression eller hyperphosphorylering viste sig at nedregulere BDNF-ekspression i primære neuroner og AD-dyremodeller 33,34,35. Derudover blev BDNF rapporteret at have beskyttende virkninger på β-amyloidinduceret neurotoksicitet in vitro og in vivo³⁶. Direkte BDNF-administration i rottehjernen viste sig at øge indlæring og hukommelse hos kognitivt svækkede dyr³⁷. BDNF / TrkB opstod som et gyldigt mål for at forbedre neurologiske og psykiatriske lidelser, herunder AD^28,38. Målretning af BDNF/TrkB-signalvejen til udvikling af terapier i AD vil potentielt forbedre vores forståelse af sygdommen³⁹. Desværre kan BDNF i sig selv ikke anvendes som behandling på grund af dets dårlige farmakokinetiske egenskaber og negative bivirkninger⁴⁰. Små molekyleaktivatorer af TrkB / BDNF-veje er blevet undersøgt som potentielle TrkB-ligander 41,42,43. Blandt testede agonister med små molekyler har 7,8-dihydroxyflavon (7,8-DHF) vist sig at aktivere BDNF/TrkB-vejen 41,44,45,46. Et derivat af 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diylbis(methylcarbamat)) overvejes i øjeblikket som et muligt lægemiddel til AD⁴⁷. For nylig blev det vist, at flere antidepressiva virker gennem direkte binding til TrkB og fremme af BDNF-signalering, hvilket yderligere understreger vigtigheden af at forfølge TrkB som et gyldigt mål til behandling af forskellige neurologiske lidelser⁴⁸.

Protokollen beskriver processen med at samle funktionel TrkB-kolonne og TrkB-NULL negativ kontrolkolonne. Kolonnerne er karakteriseret ved hjælp af et kendt naturprodukt småmolekylær ligand: 7,8-DHF. Derudover beskriver vi processen med screening af komplekse matricer ved hjælp af planteekstrakt som et eksempel til identifikation af forbindelser, der interagerer med TrkB.

Protocol

1. Cellekultur af SH-SY5Y neuroblastomceller (TrkB og TrkB-NULL (forældre) cellelinjer) BEMÆRK: Cellelinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) og SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 blev købt hos Kerafast. Dyrkede celler anvendes som en kilde til de transmembranreceptorer, der skal immobiliseres til fremstilling af CMAC-kolonner. Følgende trin beskriver, hvordan man opnår cellemembranfragmenter og samler funkti…

Representative Results

Efter protokollen blev to CMAC-kromatografiske kolonner samlet: en med de immobiliserede SH-SY5Y neuroblastomcellemembranfragmenter med overudtrykt TrkB og en med SH-SY5Y TrkB-NULL cellemembranfragmenter. Den korrekt monterede CMAC-kolonne er vist i figur 1, og de trin, der er involveret i immobilisering af cellemembranfragmenter, er vist i figur 2. Siden immobiliseringen af TrkB-receptorer på IAM. Personlig computer. DD2 kromatograf…

Discussion

Identifikation af aktive forbindelser til stede i komplekse blandinger af specialiserede metabolitter er en meget udfordrende opgave²³. Traditionelt isoleres individuelle forbindelser, og deres aktivitet testes i forskellige assays. Denne fremgangsmåde er tidskrævende og dyr og fører ofte til isolering og identifikation af de mest rigelige og velkarakterierede forbindelser²³. I øjeblikket anvendes screeningsassays med høj kapacitet og er stærkt afhængige af screenin…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA