Protokollen beskriver fremstillingen af cellemembranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner med immobiliserede cellemembranfragmenter indeholdende funktionelle transmembrantropomyosinkinasereceptor B-proteiner. Anvendelsen af CMAC-kolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med disse receptorer og er til stede i komplekse naturlige blandinger, forklares også.
Kemikalier syntetiseret af planter, svampe, bakterier og marine hvirvelløse dyr har været en rig kilde til nye lægemiddelhits og bly. Lægemidler som statiner, penicillin, paclitaxel, rapamycin eller artemisinin, der almindeligvis anvendes i medicinsk praksis, er først blevet identificeret og isoleret fra naturlige produkter. Identifikation og isolering af biologisk aktive specialiserede metabolitter fra naturlige kilder er imidlertid en udfordrende og tidskrævende proces. Traditionelt isoleres og renses individuelle metabolitter fra komplekse blandinger efter ekstraktion af biomasse. Derefter testes de isolerede molekyler i funktionelle assays for at verificere deres biologiske aktivitet. Her præsenterer vi brugen af cellulære membranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner til at identificere biologisk aktive forbindelser direkte fra komplekse blandinger. CMAC-kolonner giver mulighed for identifikation af forbindelser, der interagerer med immobiliserede funktionelle transmembranproteiner (TMP’er) indlejret i deres oprindelige phospholipid-dobbeltlagsmiljø. Dette er en målrettet tilgang, som kræver, at man kender den TMP, hvis aktivitet man har til hensigt at modulere med den nyligt identificerede lægemiddelkandidat til små molekyler. I denne protokol præsenterer vi en tilgang til at forberede CMAC-kolonner med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B (TrkB), som har vist sig som et levedygtigt mål for lægemiddelopdagelse for adskillige nervesystemforstyrrelser. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til at samle CMAC-kolonnen med immobiliserede TrkB-receptorer ved hjælp af neuroblastomcellelinjer, der overudtrykker TrkB-receptorer. Vi præsenterer yderligere tilgangen til at undersøge kolonnens funktionalitet og dens anvendelse til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med TrkB-receptorer.
Botaniske blandinger er rige på farmakologisk aktive forbindelser1, der tjener som en god kilde til identifikation af nye lægemiddelhits og fører 2,3,4,5. Opdagelsen af nye lægemidler fra naturlige produkter har været en frugtbar tilgang, og mange aktuelt godkendte lægemidler stammer fra forbindelser, der først blev identificeret i naturen. Den kemiske mangfoldighed af naturlige forbindelser er svær at matche af menneskeskabte biblioteker af kemisk syntetiserede molekyler. Mange naturlige forbindelser interagerer med og modulerer humane proteinmål og kan betragtes som evolutionært optimerede lægemiddellignende molekyler6. Disse naturlige forbindelser er særligt velegnede til identifikation af lægemiddellende til brug ved neurologiske lidelser6. To af de i øjeblikket FDA-godkendte lægemidler til behandling af Alzheimers sygdom (AD) er afledt af naturlige alkaloider, nemlig: galantamin og rivastigmin (et derivat af physostigmin)6. L-DOPA, i øjeblikket det mest almindeligt foreskrevne lægemiddel til Parkinsons sygdom, blev først identificeret fra den brede bønne (Vicia faba L.) 7. Pergolid og lisurid, dopaminerge receptoragonister er derivaterne af naturlige ergotalkaloider fra den parasitære svamp Claviceps purpurea8. Reserpin, et alkaloid isoleret fra indisk slangerod (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var et af de første antipsykotiske lægemidler9. For nylig har dysreguleret immunrespons og systemisk inflammation været forbundet med udviklingen af adskillige neurologiske lidelser, såsom større depressiv lidelse eller neurodegenerative sygdomme10. En plantebaseret kost sammen med andre livsstilsinterventioner har vist sig at forbedre kognitive og funktionelle evner hos ældre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Visse elektrofile molekyler, der tilhører triterpener og polyfenoler, har vist sig at modulere inflammatoriske reaktioner i både in vitro– og in vivo-modeller 12. For eksempel interfererer naturlige forbindelser indeholdende α.β-umættet carbonyl (f.eks. Curcumin, cinnamaldehyd) eller isothiocyanatgruppe (f.eks. Sulforafan) med Toll-lignende receptor-4 (TLR4) dimerisering, der hæmmer nedstrømssyntesen af proinflammatoriske cytokiner i en murininterleukin-3-afhængig pro-B-cellelinje12,22 . Epidemiologisk dokumentation peger stærkt på, at fytokemikalier i kosten, der findes i komplekse fødevarematricer, også kan udgøre en levedygtig kilde til nye lægemiddelledninger6.
En af de største hindringer for identifikationen af biologisk aktive molekyler i planteekstrakter, herunder plantebaserede fødevarer, er kompleksiteten af de undersøgte prøver. Traditionelt isoleres, renses de enkelte forbindelser og testes efterfølgende for biologisk aktivitet. Denne tilgang fører normalt til identifikation af de mest rigelige og velkarakterierede forbindelser. Fænotypiske lægemiddelopdagelsesmetoder uden et defineret molekylært mål er afhængige af biostyret fraktionering af komplekse blandinger23. I denne fremgangsmåde fraktioneres et ekstrakt i mindre komplekse underfraktioner, der efterfølgende testes i fænotypiske assays. Isolering og oprensning af aktive forbindelser styres af biologisk aktivitet verificeret i assayet. Kendskabet til identiteten af et specificeret lægemiddelmål kan i væsentlig grad fremskynde identifikationen af farmakologisk aktive forbindelser, der er til stede i komplekse blandinger. Disse tilgange er normalt baseret på immobilisering af det molekylære mål, for eksempel et enzym, på en fast overflade, som magnetiske perler23. De immobiliserede mål anvendes efterfølgende i screeningsforsøgene, hvilket resulterer i isolering af forbindelser, der interagerer med målet. Mens denne tilgang i vid udstrækning er blevet anvendt til identifikation af forbindelser rettet mod cytosoliske proteiner, er den blevet mindre almindeligt anvendt til identifikation af kemikalier, der interagerer med transmembranproteiner (TMP’er)23. En yderligere udfordring i immobiliseringen af TMP’er stammer fra det faktum, at proteinets aktivitet afhænger af dets interaktion med cellemembranphospholipider og andre molekyler i dobbeltlagstoget, såsom kolesterol23,24. Det er vigtigt at bevare disse subtile interaktioner mellem proteiner og deres oprindelige phospholipid dobbeltlagsmiljø, når man forsøger at immobilisere transmembranmålet.
I cellulær membranaffinitetskromatografi (CMAC) immobiliseres cellemembranfragmenter og ikke oprensede proteiner på de stationære fasepartikler af kunstig membran (IAM)23. IAM stationære faser fremstilles ved kovalent binding af phosphatidylcholinanaloger på silica. For nylig er der udviklet nye klasser af IAM stationære faser, hvor frie amin- og silanolgrupper er ende-capped (IAM. Personlig computer. DD2 partikler). Under CMAC-kolonnernes forberedelse immobiliseres cellemembranfragmenter på overfladen af IAM-partikler gennem adsorption.
CMAC-kolonner er blevet brugt til dato til at immobilisere forskellige klasser af TMP’er, herunder ionkanaler (f.eks. Nikotinreceptorer), GPCR’er (f.eks. Opioidreceptorer), proteintransportører (f.eks. P-glycoprotein) osv.24. De immobiliserede proteinmål er blevet anvendt til karakterisering af farmakodynamik (f.eks. dissociationskonstant, Kd) eller bestemmelse af bindingskinetik (kon og koff) af små molekyleligander, der interagerer med målet, samt i processen med identifikation af potentielle nye lægemiddelledninger, der er til stede i komplekse matricer24 . Her præsenterer vi forberedelsen af CMAC-kolonner med den immobiliserede tropomyosinkinasereceptor B (TrkB), som har vist sig som et levedygtigt mål for lægemiddelopdagelse for adskillige nervesystemforstyrrelser.
Tidligere undersøgelser viste, at aktiveringen af den hjerneafledte neurotrofiske faktor (BDNF) / TrkB-vej er forbundet med forbedring af visse neurologiske lidelser, såsom AD eller større depressiv lidelse 25,26,27,28. Det blev rapporteret, at BDNF-niveauer og dets receptor TrkB-ekspression falder i AD, og lignende reduktioner forringer hippocampus funktion i dyremodeller af AD29. Nedsatte niveauer af BDNF blev rapporteret i serum og hjerne hos AD-patienter 30,31,32. Tau-overekspression eller hyperphosphorylering viste sig at nedregulere BDNF-ekspression i primære neuroner og AD-dyremodeller 33,34,35. Derudover blev BDNF rapporteret at have beskyttende virkninger på β-amyloidinduceret neurotoksicitet in vitro og in vivo36. Direkte BDNF-administration i rottehjernen viste sig at øge indlæring og hukommelse hos kognitivt svækkede dyr37. BDNF / TrkB opstod som et gyldigt mål for at forbedre neurologiske og psykiatriske lidelser, herunder AD28,38. Målretning af BDNF/TrkB-signalvejen til udvikling af terapier i AD vil potentielt forbedre vores forståelse af sygdommen39. Desværre kan BDNF i sig selv ikke anvendes som behandling på grund af dets dårlige farmakokinetiske egenskaber og negative bivirkninger40. Små molekyleaktivatorer af TrkB / BDNF-veje er blevet undersøgt som potentielle TrkB-ligander 41,42,43. Blandt testede agonister med små molekyler har 7,8-dihydroxyflavon (7,8-DHF) vist sig at aktivere BDNF/TrkB-vejen 41,44,45,46. Et derivat af 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diylbis(methylcarbamat)) overvejes i øjeblikket som et muligt lægemiddel til AD47. For nylig blev det vist, at flere antidepressiva virker gennem direkte binding til TrkB og fremme af BDNF-signalering, hvilket yderligere understreger vigtigheden af at forfølge TrkB som et gyldigt mål til behandling af forskellige neurologiske lidelser48.
Protokollen beskriver processen med at samle funktionel TrkB-kolonne og TrkB-NULL negativ kontrolkolonne. Kolonnerne er karakteriseret ved hjælp af et kendt naturprodukt småmolekylær ligand: 7,8-DHF. Derudover beskriver vi processen med screening af komplekse matricer ved hjælp af planteekstrakt som et eksempel til identifikation af forbindelser, der interagerer med TrkB.
Identifikation af aktive forbindelser til stede i komplekse blandinger af specialiserede metabolitter er en meget udfordrende opgave23. Traditionelt isoleres individuelle forbindelser, og deres aktivitet testes i forskellige assays. Denne fremgangsmåde er tidskrævende og dyr og fører ofte til isolering og identifikation af de mest rigelige og velkarakterierede forbindelser23. I øjeblikket anvendes screeningsassays med høj kapacitet og er stærkt afhængige af screenin…
The authors have nothing to disclose.
Z.C.A. blev støttet af Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoc Research Fellowship Program. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Center for Complimentary and Integrative Medicine fra National Institutes of Health under tildelingsnummer 1R41AT011716-01. Dette arbejde blev også delvist støttet af American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies bevilling til L.C. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
Nikon Plan Fluor | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |