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Biochemistry

Colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire pour identifier les métabolites végétaux spécialisés interagissant avec le récepteur B de la tropomyosine kinase immobilisée

Published: January 19, 2022
doi:
10.3791/63118
, , , ,
1Department of Biological Sciences,The University of Alabama, 2Department of Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmacy,Hacettepe University

Summary

Le protocole décrit la préparation de colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire (CMAC) avec des fragments de membrane cellulaire immobilisés contenant des protéines fonctionnelles du récepteur B de la tropomyosine kinase transmembranaire. L’utilisation des colonnes CMAC dans l’identification des métabolites végétaux spécialisés interagissant avec ces récepteurs et présents dans des mélanges naturels complexes est également expliquée.

Abstract

Les produits chimiques synthétisés par les plantes, les champignons, les bactéries et les invertébrés marins ont été une riche source de nouveaux médicaments et de pistes. Des médicaments tels que les statines, la pénicilline, le paclitaxel, la rapamycine ou l’artémisinine, couramment utilisés dans la pratique médicale, ont d’abord été identifiés et isolés à partir de produits naturels. Cependant, l’identification et l’isolement des métabolites spécialisés biologiquement actifs à partir de sources naturelles est un processus difficile et long. Traditionnellement, les métabolites individuels sont isolés et purifiés à partir de mélanges complexes, après l’extraction de la biomasse. Par la suite, les molécules isolées sont testées dans des tests fonctionnels pour vérifier leur activité biologique. Nous présentons ici l’utilisation de colonnes de chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire (CMAC) pour identifier les composés biologiquement actifs directement à partir de mélanges complexes. Les colonnes CMAC permettent d’identifier les composés interagissant avec les protéines transmembranaires fonctionnelles (TMP) immobilisées intégrées dans leur environnement bicouche phospholipidique natif. Il s’agit d’une approche ciblée, qui nécessite de connaître le TMP dont on entend moduler l’activité avec le candidat médicament à petite molécule nouvellement identifié. Dans ce protocole, nous présentons une approche pour préparer des colonnes CMAC avec le récepteur B immobilisé de la tropomyosine kinase (TrkB), qui est devenu une cible viable pour la découverte de médicaments pour de nombreux troubles du système nerveux. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour assembler la colonne CMAC avec des récepteurs TrkB immobilisés en utilisant des lignées cellulaires de neuroblastome surexprimant les récepteurs TrkB. Nous présentons en outre l’approche pour étudier la fonctionnalité de la colonne et son utilisation dans l’identification de métabolites végétaux spécialisés interagissant avec les récepteurs TrkB.

Introduction

Les mélanges botaniques sont riches en composés pharmacologiquement actifs1, servant de bonne source pour l’identification de nouveaux médicaments et conduit 2,3,4,5. La découverte de nouveaux médicaments à partir de produits naturels a été une approche fructueuse et de nombreux médicaments actuellement approuvés proviennent de composés identifiés pour la première fois dans la nature. La diversité chimique des composés naturels est difficile à égaler par des bibliothèques artificielles de molécules synthétisées chimiquement. De nombreux composés naturels interagissent avec et modulent des cibles protéiques humaines et peuvent être considérés comme des molécules semblables à des médicaments optimisées sur le plan de l’évolution6. Ces composés naturels sont particulièrement bien adaptés à l’identification des plombs médicamenteux à utiliser dans les troubles neurologiques6. Deux des médicaments actuellement approuvés par la FDA pour la prise en charge de la maladie d’Alzheimer (MA) sont dérivés d’alcaloïdes naturels, à savoir: la galantamine et la rivastigmine (un dérivé de la physostigmine)6. La L-DOPA, actuellement le médicament le plus couramment prescrit pour la maladie de Parkinson, a été identifiée pour la première fois à partir de la fève (Vicia faba L.) 7. Pergolide et lisuride, agonistes des récepteurs dopaminergiques sont les dérivés des alcaloïdes naturels de l’ergot du champignon parasite Claviceps purpurea8. La réserpine, un alcaloïde isolé de la racine de serpent indienne (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) a été l’un des premiers médicaments antipsychotiques9. Récemment, la réponse immunitaire dérégulée et l’inflammation systémique ont été liées au développement de nombreuses affections neurologiques, telles que les troubles dépressifs majeurs ou les maladies neurodégénératives10. Un régime à base de plantes ainsi que d’autres interventions sur le mode de vie ont été trouvés pour améliorer les capacités cognitives et fonctionnelles chez lespersonnes âgées 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Certaines molécules électrophiles appartenant aux triterpènes et aux polyphénols ont été trouvées pour moduler les réponses inflammatoires dans les modèles in vitro et in vivo 12. Par exemple, les composés naturels contenant du α β carbonyle insaturé (p. ex., curcumine, cinnamaldéhyde) ou du groupe isothiocyanate (p. ex., sulforaphane) interfèrent avec la dimérisation du récepteur 4 de type Toll (TLR4) inhibant la synthèse en aval de cytokines pro-inflammatoires dans une lignée cellulaire pro-B dépendante de l’interleukine-3 murine12,22 . Les données épidémiologiques indiquent clairement que les composés phytochimiques alimentaires, présents dans les matrices alimentaires complexes, peuvent également constituer une source viable de nouveaux médicaments6.

L’un des principaux obstacles à l’identification des molécules biologiquement actives présentes dans les extraits de plantes, y compris les aliments à base de plantes, est la complexité des échantillons étudiés. Traditionnellement, les composés individuels sont isolés, purifiés et ensuite testés pour leur activité biologique. Cette approche conduit généralement à l’identification des composés les plus abondants et les mieux caractérisés. Les approches phénotypiques de découverte de médicaments sans cible moléculaire définie reposent sur le fractionnement bioguidé de mélanges complexes23. Dans cette approche, un extrait est fractionné en sous-fractions moins complexes qui sont ensuite testées dans des essais phénotypiques. L’isolement et la purification des composés actifs sont guidés par l’activité biologique vérifiée dans le test. La connaissance de l’identité d’une cible médicamenteuse spécifiée peut accélérer considérablement l’identification des composés pharmacologiquement actifs présents dans les mélanges complexes. Ces approches sont généralement basées sur l’immobilisation de la cible moléculaire, par exemple, une enzyme, sur une surface solide, comme les billes magnétiques23. Les cibles immobilisées sont ensuite utilisées dans les expériences de criblage, ce qui permet d’isoler les composés interagissant avec la cible. Bien que cette approche ait été largement utilisée dans l’identification de composés ciblant les protéines cytosoliques, elle a été moins couramment appliquée dans l’identification des produits chimiques interagissant avec les protéines transmembranaires (TMP)23. Un défi supplémentaire dans l’immobilisation des TMP provient du fait que l’activité de la protéine dépend de son interaction avec les phospholipides de la membrane cellulaire et d’autres molécules dans la bicouche telles que le cholestérol23,24. Il est important de préserver ces interactions subtiles entre les protéines et leur environnement bicouche phospholipidique natif lorsque l’on tente d’immobiliser la cible transmembranaire.

Dans la chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire (CMAC), les fragments de membrane cellulaire, et non les protéines purifiées, sont immobilisés sur les particules de phase stationnaire de la membrane artificielle (IAM)23. Les phases stationnaires IAM sont préparées en liant de manière covalente des analogues de la phosphatidylcholine sur de la silice. Récemment, de nouvelles classes de phases stationnaires IAM ont été développées dans lesquelles les groupes amine et silanol libres sont plafonnés (IAM. PC. Particules DD2). Au cours de la préparation des colonnes CMAC, des fragments de membrane cellulaire sont immobilisés à la surface des particules IAM par adsorption.

Les colonnes de l’ACMC ont été utilisées à ce jour pour immobiliser différentes classes de TMP, y compris les canaux ioniques (p. ex., les récepteurs nicotiniques), les RCPG (p. ex., les récepteurs opioïdes), les transporteurs de protéines (p. ex., p-glycoprotéine), etc.24. Les cibles protéiques immobilisées ont été utilisées dans la caractérisation de la pharmacodynamique (p. ex., constante de dissociation, Kd) ou dans la détermination de la cinétique de liaison (kon et koff) de ligands de petites molécules interagissant avec la cible ainsi que dans le processus d’identification de nouveaux médicaments potentiels présents dans des matrices complexes24 . Nous présentons ici la préparation de colonnes CMAC avec le récepteur immobilisé de la tropomyosine kinase B (TrkB), qui est devenu une cible viable pour la découverte de médicaments pour de nombreux troubles du système nerveux.

Des études antérieures ont montré que l’activation de la voie du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) / TrkB est associée à l’amélioration de certaines affections neurologiques, telles que la MA ou le trouble dépressif majeur 25,26,27,28. Il a été rapporté que les niveaux de BDNF et son expression de récepteur TrkB diminuent dans la MA, et des réductions similaires altèrent la fonction hippocampique dans les modèles animaux de AD29. Une diminution des taux de BDNF a été rapportée dans le sérum et le cerveau des patients atteints de MA 30,31,32. La surexpression de Tau ou l’hyperphosphorylation régulent à la baisse l’expression du BDNF dans les neurones primaires et les modèles animaux AD 33,34,35. De plus, le BDNF aurait des effets protecteurs sur la neurotoxicité induite par la β-amyloïde in vitro et in vivo36. Il a été démontré que l’administration directe de BDNF dans le cerveau du rat augmentait l’apprentissage et la mémoire chez les animaux atteints de troubles cognitifs37. BdNF /TrkB est apparu comme une cible valide pour améliorer les troubles neurologiques et psychiatriques, y compris AD28,38. Le ciblage de la voie de signalisation BDNF/TrkB pour le développement de thérapies dans la MA améliorera potentiellement notre compréhension de la maladie39. Malheureusement, le BDNF lui-même ne peut pas être utilisé comme traitement en raison de ses mauvaises propriétés pharmacocinétiques et de ses effets secondaires indésirables40. Les activateurs de petites molécules des voies TrkB/BDNF ont été explorés en tant que ligands TrkB potentiels 41,42,43. Parmi les agonistes de petites molécules testés, la 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF), il a été démontré qu’il active la voie BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un dérivé du 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phényl-4H-chromene-7,8-diyl bis(méthylcarbamate)) est actuellement à l’étude comme médicament possible pour AD47. Récemment, il a été démontré que plusieurs antidépresseurs agissent en se liant directement au TrkB et en favorisant la signalisation du BDNF, soulignant davantage l’importance de poursuivre le TrkB comme cible valide pour traiter divers troubles neurologiques48.

Le protocole décrit le processus d’assemblage de la colonne TrkB fonctionnelle et de la colonne de contrôle négatif TrkB-NULL. Les colonnes sont caractérisées à l’aide d’un ligand de petite molécule de produit naturel connu: le 7,8-DHF. En outre, nous décrivons le processus de criblage de matrices complexes, en utilisant l’extrait de plante comme exemple, pour l’identification des composés interagissant avec TrkB.

Protocol

1. Culture cellulaire de cellules de neuroblastome SH-SY5Y (lignées cellulaires TrkB et TrkB-NULL (parentales)) REMARQUE: Lignées cellulaires (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) et SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL)))49,50 ont été achetées auprès de Kerafast. Les cellules cultivées sont utilisées comme source des récepteurs transmembranaires à immobiliser pour la préparation des colonnes CMAC. Les étapes suiva…

Representative Results

Suivant le protocole, deux colonnes chromatographiques du CMAC ont été assemblées : l’une avec les fragments de membrane cellulaire du neuroblastome SH-SY5Y immobilisés avec TrkB surexprimé et l’autre avec des fragments de membrane cellulaire SH-SY5Y TrkB-NULL. La colonne CMAC correctement assemblée est présentée à la figure 1 et les étapes impliquées dans l’immobilisation des fragments de membrane cellulaire sont présentées à la figure 2.</p…

Discussion

L’identification des composés actifs présents dans les mélanges complexes de métabolites spécialisés est une tâche très difficile23. Traditionnellement, les composés individuels sont isolés et leur activité est testée dans différents essais. Cette approche est longue et coûteuse et conduit souvent à l’isolement et à l’identification des composés les plus abondants et les mieux caractérisés23. Les essais de criblage à haut débit actuellement utili…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Z.C.A. a été soutenu par le Conseil de la recherche scientifique et technologique de Turquie (TUBITAK) 2219 – Programme international de bourses de recherche postdoctorale. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Center for Complementarary and Integrative Medicine des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution 1R41AT011716-01. Ce travail a également été partiellement soutenu par l’American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, la subvention Regis Technologies à L.C. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate Sigma-Aldrich D5446-10 mg ≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383-1 g
Ammonium acetate VWR Chemicals BDH BDH9204-500 g
BDNF antibody Invitrogen PA5-15198-400 μL Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human Sigma-Aldrich B3795-10 μg Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride VWR Analytical BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt Alfa Aesar J62050-100 g
Dounce homogenizer VWR 71000-516 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR Analytical BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500 mL sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution Sigma-Aldrich G8168-100 mL 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol VWR Life Science E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) Regis Technologies, Inc. 1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate VWR Analytical BDH9244-500 mL
Methanol Sigma-Aldrich 322425
Nikon Plan Fluor Nikon Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%) Life Technologies 50197Z
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Thermo Scientific 36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS) VWR Life Science K812-500 mL 1x
Potassium chloride VWR Chemicals BDH 0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail VWR Life Science Ambreso M221-1 mL Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758-500 mL with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen Alexa Flour Plus 488 A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B Kerafast ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line Kerafast ECP005
Snake skin dialysis tubing Thermo Scientific 88245 10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride BDH VWR Analytical BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column GE Healthcare 24-4064-08
Tris-HCl VWR Life Science 0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-500 mL 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA
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Arituluk, Z. C., Adhikari, B., Maitra, U., Goodman, C., Ciesla, L. M. Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B. J. Vis. Exp. (179), e63118, doi:10.3791/63118 (2022).
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