Columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular para identificar metabolitos especializados de plantas que interactúan con el receptor B inmovilizado de tropomiosina quinasa

Summary

El protocolo describe la preparación de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) con fragmentos de membrana celular inmovilizados que contienen proteínas funcionales del receptor B de tropomiosina quinasa transmembrana. También se explica el uso de columnas de CMAC en la identificación de metabolitos vegetales especializados que interactúan con estos receptores y están presentes en mezclas naturales complejas.

Abstract

Los productos químicos sintetizados por plantas, hongos, bacterias e invertebrados marinos han sido una rica fuente de nuevos golpes y plomos de drogas. Medicamentos como las estatinas, la penicilina, el paclitaxel, la rapamicina o la artemisinina, comúnmente utilizados en la práctica médica, se han identificado y aislado por primera vez de productos naturales. Sin embargo, la identificación y el aislamiento de metabolitos especializados biológicamente activos de fuentes naturales es un proceso desafiante y lento. Tradicionalmente, los metabolitos individuales se aíslan y purifican a partir de mezclas complejas, después de la extracción de biomasa. Posteriormente, las moléculas aisladas se prueban en ensayos funcionales para verificar su actividad biológica. Aquí presentamos el uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) para identificar compuestos biológicamente activos directamente a partir de mezclas complejas. Las columnas CMAC permiten la identificación de compuestos que interactúan con proteínas transmembrana funcionales inmovilizadas (TMP) incrustadas en su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos. Este es un enfoque dirigido, que requiere conocer el TMP cuya actividad se pretende modular con el candidato a fármaco de molécula pequeña recientemente identificado. En este protocolo, presentamos un enfoque para preparar columnas de CMAC con el receptor de tropomiosina quinasa B (TrkB) inmovilizado, que se ha convertido en un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para ensamblar la columna CMAC con receptores TrkB inmovilizados utilizando líneas celulares de neuroblastoma que sobreexpresan los receptores TrkB. Además, presentamos el enfoque para investigar la funcionalidad de la columna y su uso en la identificación de metabolitos especializados de plantas que interactúan con los receptores TrkB.

Introduction

Las mezclas botánicas son ricas en compuestos farmacológicamente activos¹, sirviendo como una buena fuente para la identificación de nuevos fármacos golpea y conduce 2,3,4,5. El descubrimiento de nuevos medicamentos a partir de productos naturales ha sido un enfoque fructífero y muchos medicamentos actualmente aprobados se originaron a partir de compuestos identificados por primera vez en la naturaleza. La diversidad química de los compuestos naturales es difícil de igualar por las bibliotecas artificiales de moléculas sintetizadas químicamente. Muchos compuestos naturales interactúan y modulan los objetivos de proteínas humanas y pueden considerarse moléculas similares a fármacos optimizadas evolutivamente⁶. Estos compuestos naturales son particularmente adecuados para la identificación de plomo de fármacos para su uso en trastornos neurológicos⁶. Dos de los medicamentos actualmente aprobados por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) se derivan de alcaloides naturales, a saber: galantamina y rivastigmina (un derivado de la fisostigmina)⁶. L-DOPA, actualmente el medicamento más comúnmente recetado para la enfermedad de Parkinson, se identificó por primera vez a partir del frijol ancho (Vicia faba L.) ⁷. Pergolida y lisurida, agonistas del receptor dopaminérgico son los derivados de los alcaloides naturales del cornezuelo de centeno del hongo parásito Claviceps purpurea⁸. La reserpina, un alcaloide aislado de la raíz de serpiente india (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) fue uno de los primeros fármacos antipsicóticos⁹. Recientemente, la respuesta inmune desregulada y la inflamación sistémica se han relacionado con el desarrollo de numerosas dolencias neurológicas, como el trastorno depresivo mayor o las enfermedades neurodegenerativas¹⁰. Se ha encontrado que una dieta basada en plantas junto con otras intervenciones de estilo de vida mejora las capacidades cognitivas y funcionales en los ancianos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Se ha encontrado que ciertas moléculas electrofílicas pertenecientes a triterpenos y polifenoles modulan las respuestas inflamatorias tanto en modelos in vitro como in vivo ¹². Por ejemplo, los compuestos naturales que contienen α,β carbonilo insaturado (por ejemplo, curcumina, cinamaldehído) o grupo isotiocianato (por ejemplo, sulforafano) interfieren con la dimerización del receptor Toll-4 (TLR4) que inhibe la síntesis aguas abajo de citoquinas proinflamatorias en una línea celular pro-B dependiente de interleucina-3 murina^12,22 . La evidencia epidemiológica apunta fuertemente a que los fitoquímicos dietéticos, presentes en matrices alimentarias complejas, también pueden constituir una fuente viable de nuevos fármacos⁶.

Uno de los principales obstáculos en la identificación de moléculas biológicamente activas presentes en los extractos de plantas, incluidos los alimentos de origen vegetal, es la complejidad de las muestras investigadas. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan, purifican y posteriormente se prueban para la actividad biológica. Este enfoque generalmente conduce a la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados. Los enfoques de descubrimiento de fármacos fenotípicos sin una diana molecular definida se basan en el fraccionamiento bioguiado de mezclas complejas²³. En este enfoque, un extracto se fracciona en subfracciones menos complejas que posteriormente se prueban en ensayos fenotípicos. El aislamiento y la purificación de los compuestos activos se guían por la actividad biológica verificada en el ensayo. El conocimiento de la identidad de un objetivo farmacológico específico puede acelerar significativamente la identificación de compuestos farmacológicamente activos presentes en mezclas complejas. Esos enfoques generalmente se basan en la inmovilización del objetivo molecular, por ejemplo, una enzima, en una superficie sólida, como las perlas magnéticas²³. Los objetivos inmovilizados se utilizan posteriormente en los experimentos de detección, lo que resulta en el aislamiento de compuestos que interactúan con el objetivo. Si bien este enfoque se ha utilizado ampliamente en la identificación de compuestos dirigidos a proteínas citosólicas, se ha aplicado con menos frecuencia en la identificación de sustancias químicas que interactúan con proteínas transmembrana (TMP)²³. Un desafío adicional en la inmovilización de TMP se deriva del hecho de que la actividad de la proteína depende de su interacción con fosfolípidos de membrana celular y otras moléculas en la bicapa como el colesterol^23,24. Es importante preservar estas interacciones sutiles entre las proteínas y su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos cuando se intenta inmovilizar el objetivo transmembrana.

En la cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) los fragmentos de membrana celular, y no las proteínas purificadas, se inmovilizan en las partículas de fase estacionaria de membrana artificial (IAM)²³. Las fases estacionarias de IAM se preparan uniendo covalentemente análogos de fosfatidilcolina a sílice. Recientemente se han desarrollado nuevas clases de fases estacionarias de IAM en las que los grupos de amina libre y silanol tienen un límite final (IAM. PC. Partículas DD2). Durante la preparación de las columnas CMAC, los fragmentos de membrana celular se inmovilizan en la superficie de las partículas de IAM a través de la adsorción.

Las columnas de CMAC se han utilizado hasta la fecha para inmovilizar diferentes clases de TMP, incluidos los canales iónicos (por ejemplo, receptores nicotínicos), GPCR (por ejemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por ejemplo, p-glicoproteína), ^etc.24. Las dianas proteicas inmovilizadas se han utilizado en la caracterización de la farmacodinámica (por ejemplo, constante de disociación, Kd) o en la determinación de la cinética de unión (k_on y k_off) de ligandos de moléculas pequeñas que interactúan con el objetivo, así como en el proceso de identificación de posibles nuevas derivaciones farmacológicas presentes en matrices complejas²⁴ . Aquí presentamos la preparación de columnas CMAC con el receptor inmovilizado de tropomiosina quinasa B (TrkB), que ha surgido como un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso.

Estudios previos demostraron que la activación de la vía del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)/TrkB se asocia con la mejoría de ciertas dolencias neurológicas, como la EA o el trastorno depresivo mayor 25,26,27,28. Se informó que los niveles de BDNF y su receptor TrkB de expresión disminuyen en la EA, y reducciones similares perjudican la función del hipocampo en modelos animales de AD²⁹. Se notificó disminución de los niveles de BDNF en suero y cerebro de pacientes con EA 30,31,32. Se encontró que la sobreexpresión de Tau o la hiperfosforilación regulan a la baja la expresión de BDNF en neuronas primarias y modelos animales de EA 33,34,35. Además, se informó que el BDNF tiene efectos protectores sobre la neurotoxicidad inducida por β-amiloide in vitro e in vivo³⁶. Se demostró que la administración directa de BDNF en el cerebro de la rata aumenta el aprendizaje y la memoria en animales con deterioro cognitivo³⁷. BDNF / TrkB surgió como un objetivo válido para mejorar los trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluido el^{28,38 d.C.} Dirigirse a la vía de señalización BDNF / TrkB para el desarrollo de terapias en la EA mejorará potencialmente nuestra comprensión de la enfermedad³⁹. Desafortunadamente, el BDNF en sí no se puede usar como tratamiento debido a sus pobres propiedades farmacocinéticas y efectos secundarios adversos⁴⁰. Se han explorado activadores de moléculas pequeñas de las vías TrkB/BDNF como ligandos TrkB potenciales 41,42,43. Entre los agonistas de moléculas pequeñas probados, se ha demostrado que la 7,8-dihidroxiflavona (7,8-DHF) activa la vía BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromona-7,8-diil bis(metilcarbamato)) está actualmente bajo consideración como un posible fármaco para la EA⁴⁷. Recientemente, se demostró que varios antidepresivos funcionan a través de la unión directa a TrkB y la promoción de la señalización bdNF, enfatizando aún más la importancia de perseguir TrkB como un objetivo válido para tratar diversos trastornos neurológicos⁴⁸.

El protocolo describe el proceso de ensamblaje de la columna TrkB funcional y la columna de control negativo TrkB-NULL. Las columnas se caracterizan utilizando un conocido ligando de pequeño molecular de producto natural: 7,8-DHF. Además, describimos el proceso de cribado de matrices complejas, utilizando extracto de planta como ejemplo, para la identificación de compuestos que interactúan con TrkB.

Protocol

1. Cultivo celular de células de neuroblastoma SH-SY5Y (líneas celulares TrkB y TrkB-NULL (parentales)) NOTA: Las líneas celulares (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) y SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 fueron compradas a Kerafast. Las células cultivadas se utilizan como fuente de los receptores transmembrana a inmovilizar para la preparación de columnas CMAC. Los siguientes pasos describen cómo obtener fragm…

Representative Results

Siguiendo el protocolo, se ensamblaron dos columnas cromatográficas CMAC: una con los fragmentos de membrana celular de neuroblastoma SH-SY5Y inmovilizados con TrkB sobreexpresado y otra con fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. La columna CMAC correctamente ensamblada se presenta en la Figura 1 y los pasos involucrados en la inmovilización de fragmentos de membrana celular se presentan en la Figura 2. Desde la inmoviliz…

Discussion

La identificación de compuestos activos presentes en mezclas complejas de metabolitos especializados es una tarea muy desafiante²³. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan y su actividad se prueba en diferentes ensayos. Este enfoque requiere mucho tiempo y es costoso y a menudo conduce al aislamiento y la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados²³. Los ensayos de cribado de alto rendimiento utilizados actualmente dependen en…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA