Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B

Summary

Het protocol beschrijft de bereiding van celmembraanaffiniteitschromatografie (CMAC) kolommen met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten die functionele transmembraantropomyosinekinasereceptor B-eiwitten bevatten. Het gebruik van CMAC-kolommen bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met deze receptoren en aanwezig zijn in complexe natuurlijke mengsels wordt ook uitgelegd.

Abstract

Chemicaliën gesynthetiseerd door planten, schimmels, bacteriën en ongewervelde zeedieren zijn een rijke bron van nieuwe medicijnhits en -leads. Geneesmiddelen zoals statines, penicilline, paclitaxel, rapamycine of artemisinine, vaak gebruikt in de medische praktijk, zijn voor het eerst geïdentificeerd en geïsoleerd uit natuurlijke producten. De identificatie en isolatie van biologisch actieve gespecialiseerde metabolieten uit natuurlijke bronnen is echter een uitdagend en tijdrovend proces. Traditioneel worden individuele metabolieten geïsoleerd en gezuiverd uit complexe mengsels, na de extractie van biomassa. Vervolgens worden de geïsoleerde moleculen getest in functionele assays om hun biologische activiteit te verifiëren. Hier presenteren we het gebruik van cellulaire membraanaffiniteitschromatografie (CMAC) -kolommen om biologisch actieve verbindingen rechtstreeks uit complexe mengsels te identificeren. CMAC-kolommen maken de identificatie mogelijk van verbindingen die interageren met geïmmobiliseerde functionele transmembraaneiwitten (TMP’s) ingebed in hun inheemse fosfolipide dubbellaagse omgeving. Dit is een gerichte aanpak, die vereist dat men de TMP kent waarvan men de activiteit wil moduleren met het nieuw geïdentificeerde kandidaat-geneesmiddel met kleine moleculen. In dit protocol presenteren we een aanpak om CMAC-kolommen voor te bereiden met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (TrkB), die naar voren is gekomen als een levensvatbaar doelwit voor het ontdekken van geneesmiddelen voor tal van aandoeningen van het zenuwstelsel. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol om de CMAC-kolom samen te stellen met geïmmobiliseerde TrkB-receptoren met behulp van neuroblastoomcellijnen die TrkB-receptoren overexpressie geven. We presenteren verder de aanpak om de functionaliteit van de kolom en het gebruik ervan bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met TrkB-receptoren te onderzoeken.

Introduction

Botanische mengsels zijn rijk aan farmacologisch actieve verbindingen¹, die dienen als een goede bron voor de identificatie van nieuwe medicijnhits en leads ^2,3,4,5. De ontdekking van nieuwe geneesmiddelen uit natuurlijke producten is een vruchtbare aanpak geweest en veel momenteel goedgekeurde geneesmiddelen zijn afkomstig van verbindingen die voor het eerst in de natuur zijn geïdentificeerd. De chemische diversiteit van natuurlijke verbindingen is moeilijk te evenaren door door de mens gemaakte bibliotheken van chemisch gesynthetiseerde moleculen. Veel natuurlijke verbindingen interageren met en moduleren menselijke eiwitdoelen en kunnen worden beschouwd als evolutionair geoptimaliseerde medicijnachtige moleculen⁶. Deze natuurlijke verbindingen zijn bijzonder geschikt voor de identificatie van geneesmiddellood voor gebruik bij neurologische aandoeningen⁶. Twee van de momenteel door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer (AD) zijn afgeleid van natuurlijke alkaloïden, namelijk: galantamine en rivastigmine (een derivaat van fysostigmine)⁶. Levodopa, momenteel het meest voorgeschreven medicijn voor de ziekte van Parkinson, werd voor het eerst geïdentificeerd uit de brede boon (Vicia faba L.) ⁷. Pergolide en lisuride, dopaminerge receptoragonisten zijn de derivaten van natuurlijke moederkorenalkaloïden uit de parasitaire schimmel Claviceps purpurea⁸. Reserpine, een alkaloïde geïsoleerd uit Indiase slangenwortel (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) was een van de eerste antipsychotica⁹. Onlangs zijn ontregelde immuunrespons en systemische ontsteking in verband gebracht met de ontwikkeling van tal van neurologische aandoeningen, zoals depressieve stoornissen of neurodegeneratieve ziekten¹⁰. Een plantaardig dieet samen met andere leefstijlinterventies blijkt de cognitieve en functionele vaardigheden bij ouderen te verbeteren 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Bepaalde elektrofiele moleculen die behoren tot triterpenen en polyfenolen blijken ontstekingsreacties te moduleren in zowel in vitro als in vivo modellen¹². Natuurlijke verbindingen die α,β-onverzadigde carbonyl (bijv. Curcumine, cinnamaldehyde) of isothiocyanaatgroep (bijv. Sulforafaan) bevatten, interfereren bijvoorbeeld met Toll-like receptor-4 (TLR4) dimerisatie en remmen de stroomafwaartse synthese van pro-inflammatoire cytokines in een muriene interleukine-3-afhankelijke pro-B-cellijn^12,22 . Epidemiologisch bewijs wijst er sterk op dat fytochemicaliën in de voeding, aanwezig in complexe voedselmatrices, ook een levensvatbare bron van nieuwe geneesmiddelen kunnen vormen⁶.

Een van de belangrijkste obstakels bij de identificatie van biologisch actieve moleculen die aanwezig zijn in plantenextracten, waaronder plantaardig voedsel, is de complexiteit van de onderzochte monsters. Traditioneel worden de individuele verbindingen geïsoleerd, gezuiverd en vervolgens getest op biologische activiteit. Deze aanpak leidt meestal tot de identificatie van de meest voorkomende en goed gekarakteriseerde verbindingen. Fenotypische geneesmiddelontdekkingsbenaderingen zonder een gedefinieerd moleculair doelwit zijn afhankelijk van de biogeleide fractionering van complexe mengsels²³. In deze benadering wordt een extract gefractioneerd in minder complexe subfracties die vervolgens worden getest in fenotypische assays. De isolatie en zuivering van actieve verbindingen worden geleid door biologische activiteit die in de test wordt geverifieerd. De kennis van de identiteit van een bepaald geneesmiddeldoel kan de identificatie van farmacologisch actieve verbindingen in complexe mengsels aanzienlijk versnellen. Die benaderingen zijn meestal gebaseerd op de immobilisatie van het moleculaire doelwit, bijvoorbeeld een enzym, op een vast oppervlak, zoals magnetische kralen²³. De geïmmobiliseerde doelen worden vervolgens gebruikt in de screeningsexperimenten die resulteren in de isolatie van verbindingen die interageren met het doelwit. Hoewel deze benadering op grote schaal is gebruikt bij de identificatie van verbindingen die gericht zijn op cytosolische eiwitten, is deze minder vaak toegepast bij de identificatie van chemicaliën die interageren met transmembraaneiwitten (TMP’s)²³. Een extra uitdaging bij de immobilisatie van TMP’s komt voort uit het feit dat de activiteit van het eiwit afhankelijk is van de interactie met celmembraanfosfolipiden en andere moleculen in de dubbellaag zoals cholesterol ^23,24. Het is belangrijk om deze subtiele interacties tussen eiwitten en hun inheemse fosfolipide dubbellaagse omgeving te behouden bij het immobiliseren van het transmembraandoel.

Bij cellulaire membraanaffiniteit chromatografie (CMAC) worden celmembraanfragmenten, en niet gezuiverde eiwitten, geïmmobiliseerd op de stationaire fasedeeltjes van het kunstmatige membraan (IAM^{) 23}. IAM stationaire fasen worden bereid door fosfatidylcholine analogen covalent te binden aan silica. Onlangs zijn nieuwe klassen van IAM stationaire fasen ontwikkeld waarin vrije amine- en silanolgroepen end-capped (IAM. PC. DD2 deeltjes). Tijdens cmac-kolommenvoorbereiding worden celmembraanfragmenten geïmmobiliseerd op het oppervlak van IAM-deeltjes door adsorptie.

CMAC-kolommen zijn tot nu toe gebruikt om verschillende klassen TMP’s te immobiliseren, waaronder ionkanalen (bijv. Nicotinereceptoren), GPCR’s (bijv. Opioïde receptoren), eiwittransporters (bijv. P-glycoproteïne), ^enz.24. De geïmmobiliseerde eiwitdoelen zijn gebruikt bij de karakterisering van de farmacodynamiek (bijv. Dissociatieconstante, Kd) of bij het bepalen van bindingskinetiek (k_aan en k_uit) van liganden met kleine moleculen die interageren met het doelwit, evenals bij het proces van identificatie van potentiële nieuwe geneesmiddelkabels die aanwezig zijn in complexe matrices²⁴ . Hier presenteren we de voorbereiding van CMAC-kolommen met de geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (TrkB), die naar voren is gekomen als een levensvatbaar doelwit voor medicijnontdekking voor tal van aandoeningen van het zenuwstelsel.

Eerdere studies toonden aan dat de activering van de van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) / TrkB-route geassocieerd is met de verbetering van bepaalde neurologische aandoeningen, zoals AD of depressieve^stoornis 25,26,27,28. Er werd gemeld dat BDNF-niveaus en de receptor TrkB-expressie afnemen in AD, en vergelijkbare reducties verminderen de hippocampusfunctie in diermodellen van AD²⁹. Verlaagde niveaus van BDNF werden gemeld in serum en hersenen van AD-patiënten 30,31,32. Tau-overexpressie of hyperfosforylering bleken de BDNF-expressie in primaire neuronen en AD-diermodellen te downreguleren 33,34,35. Bovendien werd gemeld dat BDNF beschermende effecten had op β-amyloïde geïnduceerde neurotoxiciteit in vitro en in vivo³⁶. Directe toediening van BDNF in de hersenen van ratten bleek het leren en geheugen te verhogen bij cognitief gehandicapte dieren³⁷. BDNF /TrkB kwam naar voren als een geldig doelwit voor het verbeteren van neurologische en psychiatrische stoornissen, waaronder AD^28,38. Het richten op de BDNF/TrkB-signaleringsroute voor de ontwikkeling van therapieën in AD zal ons begrip van de ziekte mogelijk verbeteren³⁹. Helaas kan BDNF zelf niet als behandeling worden gebruikt vanwege de slechte farmacokinetische eigenschappen en nadelige bijwerkingen⁴⁰. Kleine molecuulactivatoren van TrkB/BDNF-routes zijn onderzocht als potentiële TrkB-liganden 41,42,43. Van de geteste agonisten met kleine moleculen is aangetoond dat 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) de BDNF / TrkB-route 41,44,45,46 activeert. Een derivaat van 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamaat)) wordt momenteel overwogen als een mogelijk medicijn voor AD⁴⁷. Onlangs werd aangetoond dat verschillende antidepressiva werken door direct te binden aan TrkB en BDNF-signalering te bevorderen, waardoor het belang van het nastreven van TrkB als een geldig doelwit voor de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen verder wordt benadrukt⁴⁸.

Het protocol beschrijft het proces van het samenstellen van de functionele TrkB-kolom en de TrkB-NULL-negatieve besturingskolom. De kolommen worden gekarakteriseerd met behulp van een bekend natuurproduct kleinmoleculair ligand: 7,8-DHF. Daarnaast beschrijven we het proces van het screenen van complexe matrices, met behulp van plantenextract als voorbeeld, voor de identificatie van verbindingen die interageren met TrkB.

Protocol

1. Celkweek van SH-SY5Y neuroblastoomcellen (TrkB en TrkB-NULL (ouderlijke) cellijnen) OPMERKING: Cellijnen (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) en SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 werden gekocht bij Kerafast. Gekweekte cellen worden gebruikt als bron van de transmembraanreceptoren die moeten worden geïmmobiliseerd voor de bereiding van CMAC-kolommen. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u celmembraanfragme…

Representative Results

Volgens het protocol werden twee CMAC-chromatografische kolommen samengesteld: één met de geïmmobiliseerde SH-SY5Y neuroblastoomcelmembraanfragmenten met overexpressie TrkB en één met SH-SY5Y TrkB-NULL celmembraanfragmenten. De correct geassembleerde CMAC-kolom is weergegeven in figuur 1 en de stappen die betrokken zijn bij immobilisatie van celmembraanfragmenten zijn weergegeven in figuur 2. Sinds de immobilisatie van TrkB recep…

Discussion

Identificatie van actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe mengsels van gespecialiseerde metabolieten is een zeer uitdagende taak²³. Traditioneel worden individuele verbindingen geïsoleerd en wordt hun activiteit getest in verschillende testen. Deze aanpak is tijdrovend en kostbaar en leidt vaak tot isolatie en identificatie van de meest voorkomende en goed gekarakteriseerde verbindingen²³. De momenteel gebruikte high-throughput screeningstests zijn sterk afhank…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA