प्रोटोकॉल सेल झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (सीएमएसी) कॉलम की तैयारी का वर्णन करता है जिसमें कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी प्रोटीन युक्त स्थिर सेल झिल्ली टुकड़े होते हैं। इन रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान में सीएमएसी कॉलम का उपयोग और जटिल प्राकृतिक मिश्रण में मौजूद भी समझाया गया है।
पौधों, कवक, बैक्टीरिया और समुद्री अकशेरुकी द्वारा संश्लेषित रसायन नई दवा हिट और लीड का एक समृद्ध स्रोत रहे हैं। आमतौर पर चिकित्सा पद्धति में उपयोग की जाने वाली स्टेटिन, पेनिसिलिन, पैक्लिटैक्सेल, रैपामाइसिन, या आर्टेमिसिनिन जैसी दवाओं को पहले प्राकृतिक उत्पादों से पहचाना और अलग किया गया है। हालांकि, प्राकृतिक स्रोतों से जैविक रूप से सक्रिय विशेष मेटाबोलाइट्स की पहचान और अलगाव एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली प्रक्रिया है। परंपरागत रूप से, बायोमास के निष्कर्षण के बाद, व्यक्तिगत चयापचयों को जटिल मिश्रण से अलग और शुद्ध किया जाता है। इसके बाद, पृथक अणुओं को उनकी जैविक गतिविधि को सत्यापित करने के लिए कार्यात्मक परख में परीक्षण किया जाता है। यहां हम जटिल मिश्रण से सीधे जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान करने के लिए सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (सीएमएसी) कॉलम का उपयोग प्रस्तुत करते हैं। सीएमएसी कॉलम अपने मूल फॉस्फोलिपिड बाइलेयर वातावरण में एम्बेडेड स्थिर कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन (टीएमपी) के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। यह एक लक्षित दृष्टिकोण है, जिसके लिए टीएमपी को जानने की आवश्यकता होती है जिसकी गतिविधि एक नए पहचाने गए छोटे अणु दवा उम्मीदवार के साथ संशोधित करने का इरादा रखती है। इस प्रोटोकॉल में, हम स्थिर ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी (टीआरकेबी) के साथ सीएमएसी कॉलम तैयार करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जो कई तंत्रिका तंत्र विकारों के लिए दवा की खोज के लिए एक व्यवहार्य लक्ष्य के रूप में उभरा है। इस लेख में, हम न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों का उपयोग करके स्थिर टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ सीएमएसी कॉलम को इकट्ठा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो टीआरकेबी रिसेप्टर्स को अतिरंजित करते हैं। हम आगे कॉलम की कार्यक्षमता और टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान में इसके उपयोग की जांच करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।
वनस्पति मिश्रण औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों1 में समृद्ध हैं, जो नई दवा हिट की पहचान के लिए एक अच्छे स्रोत के रूप में कार्य करते हैं और 2,3,4,5 की ओर जाता है। प्राकृतिक उत्पादों से नई दवाओं की खोज एक उपयोगी दृष्टिकोण रही है और वर्तमान में अनुमोदित कई दवाएं प्रकृति में पहली बार पहचाने गए यौगिकों से उत्पन्न हुई हैं। प्राकृतिक यौगिकों की रासायनिक विविधता रासायनिक रूप से संश्लेषित अणुओं के मानव निर्मित पुस्तकालयों द्वारा मिलान करना मुश्किल है। कई प्राकृतिक यौगिक मानव प्रोटीन लक्ष्यों के साथ बातचीत करते हैं और संशोधित करते हैं और उन्हें विकासवादी रूप से अनुकूलित दवा जैसे अणुओं 6 माना जा सकताहै। ये प्राकृतिक यौगिक न्यूरोलॉजिकल विकारों6 में उपयोग करने के लिए दवा के नेतृत्व की पहचान के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं। अल्जाइमर रोग (एडी) के प्रबंधन के लिए वर्तमान में एफडीए-अनुमोदित दवाओं में से दो प्राकृतिक अल्कलॉइड से प्राप्त होती हैं, अर्थात्: गैलेंटामाइन और रिवेस्टिग्माइन (फिसोस्टिग्माइन का व्युत्पन्न) 6। एल-डीओपीए, वर्तमान में पार्किंसंस रोग के लिए सबसे अधिक निर्धारित दवा है, को पहली बार व्यापक बीन (विसिया फाबा एल) से पहचाना गया था। 7. पर्गोलाइड और लिसुराइड, डोपामिनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट परजीवी कवक क्लैविसेप्स पुरपुरिया8 से प्राकृतिक एर्गोट एल्कलॉइड के डेरिवेटिव हैं। रेसरपिन, भारतीय स्नेकरूट से अलग एक एल्कलॉइड (राउवोल्फिया सर्पेंटिना (एल) बेंथ पूर्व कुर्ज़) पहली एंटीसाइकोटिक दवाओं में से एक था। हाल ही में, डिस्रेगुलेटेड प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रणालीगत सूजन को कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के विकास से जोड़ा गया है, जैसे कि प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार या न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग10। अन्य जीवनशैली हस्तक्षेपों के साथ एक पौधे आधारित आहार बुजुर्गों में संज्ञानात्मक और कार्यात्मक क्षमताओं में सुधार करने के लिए पाया गया है 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . ट्राइटरपेन्स और पॉलीफेनोल से संबंधित कुछ इलेक्ट्रोफिलिक अणुओं को इन विट्रो और विवो मॉडल12 दोनों में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को संशोधित करने के लिए पाया गया है। उदाहरण के लिए, α, β-असंतृप्त कार्बोनिल (उदाहरण के लिए, कर्क्यूमिन, सिनामाल्डिहाइड), या आइसोथियोसाइनेट समूह (उदाहरण के लिए, सल्फोराफेन) युक्त प्राकृतिक यौगिक टोल-जैसे रिसेप्टर -4 (टीएलआर 4) डिमराइजेशन के साथ हस्तक्षेप करते हैं जो एक मूत्र इंटरल्यूकिन -3 निर्भर प्रो-बी सेल लाइन12,22 में प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के डाउनस्ट्रीम संश्लेषण को बाधित करते हैं . महामारी विज्ञान के साक्ष्य दृढ़ता से इंगित करते हैं कि जटिल खाद्य मैट्रिक्स में मौजूद आहार फाइटोकेमिकल्स, नई दवा लीड6 का एक व्यवहार्य स्रोत भी बना सकते हैं।
पौधे आधारित भोजन सहित पौधों के अर्क में मौजूद जैविक रूप से सक्रिय अणुओं की पहचान में प्रमुख बाधाओं में से एक जांच किए गए नमूनों की जटिलता है। परंपरागत रूप से, व्यक्तिगत यौगिकों को अलग किया जाता है, शुद्ध किया जाता है, और बाद में जैविक गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाता है। यह दृष्टिकोण आमतौर पर सबसे प्रचुर मात्रा में और अच्छी तरह से विशेषता वाले यौगिकों की पहचान की ओर जाता है। एक परिभाषित आणविक लक्ष्य के बिना फेनोटाइपिक दवा खोज दृष्टिकोण जटिल मिश्रण23 के जैव-निर्देशित-विभाजन पर निर्भर करते हैं। इस दृष्टिकोण में, एक अर्क को कम जटिल उप-अंशों में विभाजित किया जाता है जिन्हें बाद में फेनोटाइपिक परख में परीक्षण किया जाता है। अलगाव और सक्रिय यौगिकों की शुद्धि परख में सत्यापित जैविक गतिविधि द्वारा निर्देशित कर रहे हैं। एक निर्दिष्ट दवा लक्ष्य की पहचान का ज्ञान जटिल मिश्रण में मौजूद औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान को काफी तेज कर सकता है। वे दृष्टिकोण आमतौर पर आणविक लक्ष्य के स्थिरीकरण पर आधारित होते हैं, उदाहरण के लिए, एक एंजाइम, एक ठोस सतह पर, चुंबकीय मोती23 की तरह। स्थिर लक्ष्यों का उपयोग बाद में स्क्रीनिंग प्रयोगों में किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप लक्ष्य के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों का अलगाव होता है। जबकि साइटोसोलिक प्रोटीन को लक्षित करने वाले यौगिकों की पहचान में इस दृष्टिकोण का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, यह आमतौर पर ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन (टीएमपी) 23 के साथ बातचीत करने वाले रसायनों की पहचान में कम लागू किया गया है। टीएमपी के स्थिरीकरण में एक अतिरिक्त चुनौती इस तथ्य से उपजी है कि प्रोटीन की गतिविधि सेल झिल्ली फॉस्फोलिपिड्स और बिलेयर में अन्य अणुओं जैसे कोलेस्ट्रॉल23,24 के साथ इसकी बातचीत पर निर्भर करती है। ट्रांसमेम्ब्रेन लक्ष्य को स्थिर करने का प्रयास करते समय प्रोटीन और उनके मूल फॉस्फोलिपिड बाइलेयर वातावरण के बीच इन सूक्ष्म बातचीत को संरक्षित करना महत्वपूर्ण है।
सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (सीएमएसी) कोशिका झिल्ली टुकड़े में, और शुद्ध प्रोटीन नहीं, कृत्रिम झिल्ली (आईएएम) स्थिर चरणकणों 23 पर स्थिर हैं। आईएएम स्थिर चरणों को सिलिका पर सहसंयोजक रूप से बंधन फॉस्फेटिडाइलकोलाइन एनालॉगद्वारा तैयार किया जाता है। हाल ही में आईएएम स्थिर चरणों के उपन्यास वर्ग विकसित किए गए हैं जिसमें मुफ्त अमीन और सिलानोल समूहों को अंत-कैप्ड (आईएएम) किया गया है। पीसी। डीडी 2 कण)। सीएमएसी कॉलम तैयारी के दौरान सेल झिल्ली के टुकड़े सोखना के माध्यम से आईएएम कणों की सतह पर स्थिर होते हैं।
सीएमएसी कॉलम का उपयोग आयन चैनलों (जैसे, निकोटिनिक रिसेप्टर्स), जीपीसीआर (जैसे, ओपियोइड रिसेप्टर्स), प्रोटीन ट्रांसपोर्टर्स (जैसे, पी-ग्लाइकोप्रोटीन), आदि सहित टीएमपी के विभिन्न वर्गों को स्थिर करने के लिए किया गया है। स्थिर प्रोटीन लक्ष्यों का उपयोग फार्माकोडायनामिक्स (जैसे, पृथक्करण स्थिरांक, केडी) के लक्षण वर्णन में किया गया है या लक्ष्य के साथ बातचीत करने वाले छोटे अणु लिगैंडों के बाध्यकारी कैनेटीक्स (केऑन और केऑफ) का निर्धारण करने के साथ-साथ जटिल मैट्रिक्स 24 में मौजूद संभावित नई दवा लीड की पहचान की प्रक्रिया में किया गयाहै। . यहां हम स्थिर ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी (टीआरकेबी) के साथ सीएमएसी कॉलम की तैयारी प्रस्तुत करते हैं, जो कई तंत्रिका तंत्र विकारों के लिए दवा की खोज के लिए एक व्यवहार्य लक्ष्य के रूप में उभरा है।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ) / टीआरकेबी मार्ग की सक्रियता कुछ न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में सुधार के साथ जुड़ी हुई है, जैसे कि एडी या प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार 25,26,27,28। यह बताया गया था कि बीडीएनएफ स्तर और इसके रिसेप्टर टीआरकेबी अभिव्यक्ति एडी में कम हो जाती है, और इसी तरह की कटौती एडी29 के पशु मॉडल में हिप्पोकैम्पल फ़ंक्शन को खराब करती है। एडी रोगियों30,31,32 के सीरम और मस्तिष्क में बीडीएनएफ के कम स्तर की सूचना दी गई थी। ताऊ अतिअभिव्यक्ति या हाइपरफॉस्फोराइलेशन को प्राथमिक न्यूरॉन्स और एडी पशु मॉडल33,34,35 में बीडीएनएफ अभिव्यक्ति को कम करने के लिए पाया गया था। इसके अतिरिक्त, बीडीएनएफ को इन विट्रो और विवो36 में β-अमाइलॉइड प्रेरित न्यूरोटॉक्सिसिटी पर सुरक्षात्मक प्रभाव होने की सूचना दी गई थी। चूहे के मस्तिष्क में प्रत्यक्ष बीडीएनएफ प्रशासन संज्ञानात्मक रूप से बिगड़ा हुआ जानवरों37 में सीखने और स्मृति को बढ़ाने के लिए दिखाया गया था। बीडीएनएफ / टीआरकेबी एडी28,38 सहित न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों को सुधारने के लिए एक वैध लक्ष्य के रूप में उभरा। एडी में उपचार के विकास के लिए बीडीएनएफ / टीआरकेबी सिग्नलिंग मार्ग को लक्षित करना संभावित रूप से बीमारी39 की हमारी समझ को बढ़ाएगा। दुर्भाग्य से, बीडीएनएफ को अपने खराब फार्माकोकाइनेटिक गुणों और प्रतिकूलदुष्प्रभावों 40 के कारण उपचार के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है। बीडीएनएफ मार्गों के छोटे अणु उत्प्रेरकों को संभावित टीआरकेबी लिगैंड41,42,43 के रूप में खोजा गया है। परीक्षण किए गए छोटे अणु एगोनिस्टों में, 7,8-डाइहाइड्रॉक्सीफ्लेवोन (7,8-डीएचएफ), को बीडीएनएफ / टीआरकेबी मार्ग 41,44,45,46 को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है। 7,8-डीएचएफ (आर 13; 4-ऑक्सो-2-फिनाइल-4 एच-क्रोमेन -7,8-डायल बिस (मिथाइलकार्बामेट)) का व्युत्पन्न वर्तमान में एडी47 के लिए संभावित दवा के रूप में विचाराधीन है। हाल ही में, यह दिखाया गया था कि कई एंटीडिपेंटेंट्स टीआरकेबी को सीधे बाध्यकारी और बीडीएनएफ सिग्नलिंग को बढ़ावा देने के माध्यम से काम करते हैं, आगे विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों48 के इलाज के लिए एक वैध लक्ष्य के रूप में टीआरकेबी का पीछा करने के महत्व पर जोर देते हैं।
प्रोटोकॉल कार्यात्मक टीआरकेबी कॉलम और टीआरकेबी-नल नकारात्मक नियंत्रण कॉलम को इकट्ठा करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। स्तंभों को एक ज्ञात प्राकृतिक उत्पाद छोटे-आणविक लिगैंड का उपयोग करके विशेषता है: 7,8-डीएचएफ। इसके अतिरिक्त, हम टीआरकेबी के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों की पहचान के लिए, एक उदाहरण के रूप में पौधे निकालने का उपयोग करके जटिल मैट्रिक्स की स्क्रीनिंग की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
विशेष मेटाबोलाइट्स के जटिल मिश्रण में मौजूद सक्रिय यौगिकों की पहचान एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण कार्य23 है। परंपरागत रूप से, व्यक्तिगत यौगिकों को अलग किया जाता है, और उनकी गतिविधि का परीक्षण विभिन?…
The authors have nothing to disclose.
जेडसीए को तुर्की के वैज्ञानिक और तकनीकी अनुसंधान परिषद (टीयूबीआईटीएके) 2219- इंटरनेशनल पोस्टडॉक्टोरल रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या 1आर 41 एटी 011716-01 के तहत नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल सेंटर फॉर कॉम्प्लिमेंट्री एंड इंटीग्रेटिव मेडिसिन द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को आंशिक रूप से अमेरिकन सोसाइटी ऑफ फार्माकोग्नोसी रिसर्च स्टार्टर ग्रांट, एलसी को रेगिस टेक्नोलॉजीज अनुदान द्वारा भी समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।
7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
Nikon Plan Fluor | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |